Մոդիկի փոփոխությունների կենդանական մոդել ստեղծելու համար գոտկային ենթախոնդրալ ոսկորի մեջ իմպլանտացված ինքնածին պուլպոզային կորիզ։

Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի սահմանափակ CSS աջակցություն: Լավագույն արդյունքի հասնելու համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել ավելի նոր դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչ այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Մոդիկ փոփոխության (ՄՓ) կենդանական մոդելների ստեղծումը ՄՓ ուսումնասիրության կարևոր հիմք է: Հիսունչորս նորզելանդական սպիտակ ճագարներ բաժանվել են կեղծ վիրահատության խմբի, մկանների իմպլանտացիայի խմբի (ՄՓ խումբ) և միջուկի պուլպոսուսի իմպլանտացիայի խմբի (ՆՊԷ խումբ): ՆՊԷ խմբում միջողնային սկավառակը բացահայտվել է առաջային կողմնային գոտկային վիրաբուժական մոտեցմամբ, և ասեղով ծակվել է L5 ողնաշարի մարմինը ծայրային թիթեղի մոտ: ՆՊ-ն հանվել է L1/2 միջողնային սկավառակից ներարկիչով և ներարկվել դրա մեջ: Անցք է բացվել ենթախոնդրալ ոսկրում: Մկանի իմպլանտացիայի խմբում և կեղծ վիրահատության խմբում վիրաբուժական միջամտությունները և հորատման մեթոդները նույնն էին, ինչ ՆՊ իմպլանտացիայի խմբում: ՄՓ խմբում մկանի մի կտոր տեղադրվել է անցքի մեջ, մինչդեռ կեղծ վիրահատության խմբում ոչինչ չի տեղադրվել անցքի մեջ: Վիրահատությունից հետո կատարվել են ՄՌՏ սկանավորում և մոլեկուլային կենսաբանական փորձարկումներ: ՆՊԷ խմբում ազդանշանը փոխվել է, բայց կեղծ վիրահատության խմբում և ՄՓ խմբում ազդանշանի ակնհայտ փոփոխություն չի եղել: Հյուսվածաբանական դիտարկումը ցույց տվեց, որ իմպլանտացիայի տեղում դիտվել է հյուսվածքների աննորմալ պրոլիֆերացիա, և NPE խմբում ավելացել է IL-4, IL-17 և IFN-γ էքսպրեսիան: NP-ի ենթախոնդրալ ոսկորի մեջ իմպլանտացիան կարող է ձևավորել MC-ի կենդանական մոդել:
Մոդիկ փոփոխությունները (ՄՓ) ողնաշարի ծայրային թիթեղների և հարակից ոսկրածուծի վնասվածքներ են, որոնք տեսանելի են մագնիսական ռեզոնանսային պատկերման (ՄՌՊ) միջոցով: Դրանք բավականին տարածված են ուղեկցող ախտանիշներ ունեցող անհատների մոտ1: Շատ ուսումնասիրություններ ընդգծել են ՄՓ-ի կարևորությունը՝ մեջքի ստորին հատվածի ցավի (ԳՑՑ) հետ դրա կապի պատճառով2,3: դե Ռուսը և այլք4 և Մոդիկը և այլք5 անկախ կերպով առաջին անգամ նկարագրել են ողնաշարի ոսկրածուծի ենթախոնդրալ ազդանշանային անոմալիաների երեք տարբեր տեսակներ: Մոդիկ I տիպի փոփոխությունները հիպոինտենսիվ են T1-կշռված (T1W) հաջորդականությունների վրա և գերինտենսիվ՝ T2-կշռված (T2W) հաջորդականությունների վրա: Այս վնասվածքը բացահայտում է ճեղքված ծայրային թիթեղներ և հարակից անոթային գրանուլյացիոն հյուսվածք ոսկրածուծում: Մոդիկ II տիպի փոփոխությունները ցույց են տալիս բարձր ազդանշան և՛ T1W, և՛ T2W հաջորդականությունների վրա: Այս տեսակի վնասվածքի դեպքում կարող է հայտնաբերվել ծայրային թիթեղների քայքայում, ինչպես նաև հարակից ոսկրածուծի հյուսվածաբանական ճարպային փոխարինում: Մոդիկ III տիպի փոփոխությունները ցույց են տալիս ցածր ազդանշան T1W և T2W հաջորդականություններում: Նկատվել են ծայրային թիթեղներին համապատասխանող սկլերոտիկ վնասվածքներ6: ՄԿ-ն համարվում է ողնաշարի ախտաբանական հիվանդություն և սերտորեն կապված է ողնաշարի բազմաթիվ դեգեներատիվ հիվանդությունների հետ7,8,9:
Հաշվի առնելով առկա տվյալները՝ մի շարք ուսումնասիրություններ մանրամասն պատկերացում են տվել MC-ի պատճառաբանության և ախտաբանական մեխանիզմների մասին: Ալբերտը և այլք ենթադրել են, որ MC-ն կարող է առաջանալ սկավառակի ճողվածքից8: Հուն և այլք MC-ն վերագրել են սկավառակի ծանր դեգեներացիային10: Քրոքը առաջարկել է «ներքին սկավառակի պատռվածք» հասկացությունը, որը նշում է, որ սկավառակի կրկնվող վնասվածքը կարող է հանգեցնել ծայրային թիթեղի միկրոպատռվածքների: Ճեղքի առաջացումից հետո ծայրային թիթեղի ոչնչացումը միջուկի պուլպոսուսի (NP) կողմից կարող է առաջացնել աուտոիմունային պատասխան, ինչը հետագայում հանգեցնում է MC11-ի զարգացմանը: Մա-ն և այլք կիսել են նմանատիպ տեսակետ և հայտնել, որ NP-ի կողմից առաջացած աուտոիմունային ռեակցիան կարևոր դեր է խաղում MC12-ի ախտածագման մեջ:
Իմունային համակարգի բջիջները, մասնավորապես CD4+ T օգնական լիմֆոցիտները, կարևոր դեր են խաղում աուտոիմունիտետի ախտածագման մեջ13: Վերջերս հայտնաբերված Th17 ենթաբազմությունը արտադրում է IL-17 պրոբորբոքային ցիտոկինը, խթանում է քեմոկինների արտահայտությունը և խթանում է վնասված օրգանների T բջիջները IFN-γ14 արտադրելու համար: Th2 բջիջները նույնպես յուրահատուկ դեր են խաղում իմունային պատասխանների ախտածագման մեջ: IL-4-ի արտահայտությունը որպես ներկայացուցչական Th2 բջիջ կարող է հանգեցնել ծանր իմունոպաթոլոգիական հետևանքների15:
Չնայած MC16,17,18,19,20,21,22,23,24-ի վերաբերյալ բազմաթիվ կլինիկական ուսումնասիրություններ են անցկացվել, դեռևս բացակայում են կենդանիների վրա կատարված համապատասխան փորձարարական մոդելներ, որոնք կարող են ընդօրինակել մարդկանց մոտ հաճախ հանդիպող MC գործընթացը և կարող են օգտագործվել պատճառաբանությունը կամ նոր բուժումներ, ինչպիսիք են թիրախային թերապիան, ուսումնասիրելու համար: Մինչ օրս, MC-ի միայն մի քանի կենդանիների մոդելներ են հայտնաբերվել հիմքում ընկած պաթոլոգիական մեխանիզմները ուսումնասիրելու համար:
Ալբերտի և Մայի կողմից առաջարկված աուտոիմունային տեսության հիման վրա, այս ուսումնասիրությունը ստեղծել է պարզ և վերարտադրելի ճագարի MC մոդել՝ նապաստակի ինքնափոխպատվաստման միջոցով՝ նապաստակի ոսկրային բջիջները փորված ողնաշարի ծայրային թիթեղի մոտ տեղադրելով: Այլ նպատակներն են՝ դիտարկել կենդանական մոդելների հյուսվածաբանական բնութագրերը և գնահատել նապաստակի ոսկրային բջիջների սպեցիֆիկ մեխանիզմները MC-ի զարգացման մեջ: Այս նպատակով մենք օգտագործում ենք այնպիսի մեթոդներ, ինչպիսիք են մոլեկուլային կենսաբանությունը, ՄՌՏ-ն և հյուսվածաբանական հետազոտությունները՝ MC-ի առաջընթացն ուսումնասիրելու համար:
Երկու ճագար սատկել է վիրահատության ժամանակ արյունահոսությունից, իսկ չորսը՝ ՄՌՏ հետազոտության ժամանակ անզգայացման ժամանակ։ Մնացած 48 ճագարները ողջ են մնացել և վիրահատությունից հետո որևէ վարքային կամ նյարդաբանական նշան չեն ցուցաբերել։
ՄՌՏ-ն ցույց է տալիս, որ տարբեր անցքերում ներդրված հյուսվածքի ազդանշանի ինտենսիվությունը տարբեր է: NPE խմբում L5 ողնաշարի մարմնի ազդանշանի ինտենսիվությունը աստիճանաբար փոխվել է տեղադրումից 12, 16 և 20 շաբաթ անց (T1W հաջորդականությունը ցույց է տվել ցածր ազդանշան, իսկ T2W հաջորդականությունը՝ խառը ազդանշան գումարած ցածր ազդանշան) (Նկ. 1C), մինչդեռ ներդրված մասերի մյուս երկու խմբերի ՄՌՏ պատկերները նույն ժամանակահատվածում մնացել են համեմատաբար կայուն (Նկ. 1A, B):
(Ա) Ճագարի գոտկային ողնաշարի ներկայացուցչական հաջորդական ՄՌՏ պատկերներ 3 ժամանակային կետերում: Կեղծ վիրահատության խմբի պատկերներում ազդանշանային անոմալիաներ չեն հայտնաբերվել: (Բ) ՄԷ խմբում ողնաշարի մարմնի ազդանշանային բնութագրերը նման են կեղծ վիրահատության խմբի բնութագրերին, և ժամանակի ընթացքում ներդրման տեղում ազդանշանի էական փոփոխություն չի նկատվում: (Գ) NPE խմբում ցածր ազդանշանը հստակ տեսանելի է T1W հաջորդականության մեջ, իսկ խառը ազդանշանը և ցածր ազդանշանը հստակ տեսանելի են T2W հաջորդականության մեջ: 12-շաբաթյա ժամանակահատվածից մինչև 20-շաբաթյա ժամանակահատվածում T2W հաջորդականության ցածր ազդանշանները շրջապատող պարբերաբար առաջացող բարձր ազդանշանները նվազում են:
NPE խմբում ողնաշարի մարմնի իմպլանտացիայի տեղում կարելի է տեսնել ոսկրային ակնհայտ հիպերպլազիա, և ոսկրային հիպերպլազիան 12-ից 20 շաբաթականում ավելի արագ է տեղի ունենում (Նկար 2C)՝ համեմատած NPE խմբի հետ, մոդելավորված ողնաշարային մարմիններում էական փոփոխություն չի նկատվում. կեղծ խումբ և ME խումբ (Նկար 2C) (2A,B):
(Ա) Իմպլանտացված հատվածում ողնաշարի մարմնի մակերեսը շատ հարթ է, անցքը լավ է լավանում, և ողնաշարի մարմնում հիպերպլազիա չկա։ (Բ) ՄԷ խմբում իմպլանտացված հատվածի ձևը նման է կեղծ վիրահատության խմբում եղածին, և ժամանակի ընթացքում իմպլանտացված հատվածի տեսքի մեջ ակնհայտ փոփոխություն չկա։ (Գ) Ոսկրային հիպերպլազիա է տեղի ունեցել Ոսկրային հիպերպլազիա Ոսկրային հիպերպլազիա է առաջացել Ոսկրային սկավառակի միջով դեպի հակառակ կողմի ողնաշարի մարմինը։
Հյուսվածաբանական վերլուծությունը ավելի մանրամասն տեղեկություններ է տրամադրում ոսկրագոյացման մասին: Նկար 3-ում ներկայացված են H&E-ով ներկված հետվիրահատական ​​հատվածների լուսանկարները: Կեղծ վիրահատության խմբում խոնդրոցիտները լավ դասավորված էին, և բջիջների բազմացում չէր հայտնաբերվել (Նկար 3Ա): ME խմբում իրավիճակը նման էր կեղծ վիրահատության խմբում ստեղծված իրավիճակին (Նկար 3Բ): Այնուամենայնիվ, NPE խմբում իմպլանտացիայի տեղում դիտվել է մեծ քանակությամբ խոնդրոցիտներ և NP-անման բջիջների բազմացում (Նկար 3Գ):
(Ա) Տրաբեկուլաները կարելի է տեսնել ծայրային թիթեղի մոտ, խոնդրոցիտները կոկիկ դասավորված են՝ միատարր բջիջների չափսերով և ձևով, և առանց բազմացման (40 անգամ): (Բ) ME խմբում իմպլանտացիայի տեղամասի վիճակը նման է կեղծ խմբի վիճակին: Տրաբեկուլաները և խոնդրոցիտները կարելի է տեսնել, բայց իմպլանտացիայի տեղում ակնհայտ բազմացում չկա (40 անգամ): (Բ) Կարելի է տեսնել, որ խոնդրոցիտները և NP-անման բջիջները զգալիորեն բազմանում են, և խոնդրոցիտների ձևն ու չափը անհավասար են (40 անգամ):
Ինտերլեյկին 4-ի (IL-4) մՌՆԹ-ի, ինտերլեյկին 17-ի (IL-17) մՌՆԹ-ի և ինտերֆերոն γ (IFN-γ) մՌՆԹ-ի էքսպրեսիան դիտարկվել է և՛ NPE, և՛ ME խմբերում: Երբ համեմատվել են թիրախային գեների էքսպրեսիայի մակարդակները, IL-4, IL-17 և IFN-γ գեների էքսպրեսիան NPE խմբում զգալիորեն աճել է ME խմբի և կեղծ վիրահատության խմբի համեմատ (Նկար 4) (P < 0.05): Կեղծ վիրահատության խմբի համեմատ, IL-4, IL-17 և IFN-γ-ի էքսպրեսիայի մակարդակները ME խմբում աճել են միայն աննշան չափով և չեն հասել վիճակագրական փոփոխության (P > 0.05):
NPE խմբում IL-4-ի, IL-17-ի և IFN-γ-ի mRNA արտահայտությունը ցույց տվեց զգալիորեն ավելի բարձր միտում, քան կեղծ վիրահատության խմբում և ME խմբում (P < 0.05):
Ի հակադրություն, ME խմբում արտահայտման մակարդակները նշանակալի տարբերություն չեն ցուցաբերել (P> 0.05):
mRNA-ի փոփոխված արտահայտման օրինաչափությունը հաստատելու համար իրականացվել է Western blot վերլուծություն՝ օգտագործելով առևտրային առումով մատչելի հակամարմիններ IL-4-ի և IL-17-ի դեմ։ Ինչպես ցույց է տրված նկար 5A,B-ում, ME խմբի և կեղծ վիրահատության խմբի համեմատ, NPE խմբում IL-4-ի և IL-17-ի սպիտակուցի մակարդակները զգալիորեն բարձրացել էին (P < 0.05): Կեղծ վիրահատության խմբի համեմատ, ME խմբում IL-4-ի և IL-17-ի սպիտակուցի մակարդակները նույնպես չեն հասել վիճակագրորեն նշանակալի փոփոխությունների (P> 0.05):
(Ա) NPE խմբում IL-4-ի և IL-17-ի սպիտակուցի մակարդակները զգալիորեն ավելի բարձր էին, քան ME խմբում և պլացեբո խմբում (P < 0.05): (Բ) Western blot հիստոգրամ:
Վիրահատության ընթացքում ստացված մարդկային նմուշների սահմանափակ քանակի պատճառով, ՄԿ-ի ախտածագման վերաբերյալ հստակ և մանրամասն ուսումնասիրությունները որոշ չափով դժվար են: Մենք փորձեցինք ստեղծել ՄԿ-ի կենդանական մոդել՝ դրա հնարավոր ախտաբանական մեխանիզմներն ուսումնասիրելու համար: Միաժամանակ, ռենտգենաբանական գնահատումը, հյուսվածաբանական գնահատումը և մոլեկուլային կենսաբանական գնահատումը օգտագործվել են՝ ՆՊ աուտոտրանսպլանտատի կողմից առաջացած ՄԿ-ի ընթացքը հետևելու համար: Արդյունքում, ՆՊ իմպլանտացիայի մոդելը հանգեցրեց ազդանշանի ինտենսիվության աստիճանական փոփոխության 12-շաբաթյաից մինչև 20 շաբաթական ժամանակային կետերում (խառը ցածր ազդանշան T1W հաջորդականություններում և ցածր ազդանշան T2W հաջորդականություններում), ինչը վկայում է հյուսվածքային փոփոխությունների մասին, և հյուսվածաբանական և մոլեկուլային կենսաբանական գնահատումները հաստատեցին ռենտգենաբանական ուսումնասիրության արդյունքները:
Այս փորձի արդյունքները ցույց են տալիս, որ NPE խմբում ողնաշարի մարմնի խախտման տեղում տեղի են ունեցել տեսողական և հյուսվածաբանական փոփոխություններ: Միաժամանակ, դիտարկվել է IL-4, IL-17 և IFN-γ գեների, ինչպես նաև IL-4, IL-17 և IFN-γ գեների արտահայտությունը, ինչը ցույց է տալիս, որ ողնաշարի մարմնում ինքնածին պուլպոզուսային կորիզի հյուսվածքի խախտումը կարող է առաջացնել մի շարք ազդանշանային և ձևաբանական փոփոխությունների: Հեշտ է պարզել, որ կենդանական մոդելի ողնաշարի մարմինների ազդանշանային բնութագրերը (ցածր ազդանշան T1W հաջորդականության մեջ, խառը ազդանշան և ցածր ազդանշան T2W հաջորդականության մեջ) շատ նման են մարդու ողնաշարի բջիջների բնութագրերին, և ՄՌՏ բնութագրերը նաև հաստատում են հյուսվածաբանության և ընդհանուր անատոմիայի դիտարկումները, այսինքն՝ ողնաշարի մարմնի բջիջների փոփոխությունները պրոգրեսիվող են: Չնայած սուր վնասվածքի պատճառով առաջացած բորբոքային ռեակցիան կարող է ի հայտ գալ պունկցիայից անմիջապես հետո, ՄՌՏ արդյունքները ցույց են տվել, որ աստիճանաբար աճող ազդանշանային փոփոխությունները ի հայտ են եկել պունկցիայից 12 շաբաթ անց և պահպանվել են մինչև 20 շաբաթ՝ առանց ՄՌՏ փոփոխությունների վերականգնման կամ հակադարձման որևէ նշանի: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ ինքնածին ողնաշարի նապոպրոտեինացումը ճագարների մոտ պրոգրեսիվող ՄՎ հաստատելու հուսալի մեթոդ է։
Այս պունկցիայի մոդելը պահանջում է բավարար հմտություն, ժամանակ և վիրաբուժական ջանքեր: Նախնական փորձարկումների ժամանակ պարավերտեբրալ կապանային կառուցվածքների դիսեկցիան կամ չափազանց խթանումը կարող է հանգեցնել ողնաշարի օստեոֆիտների առաջացմանը: Պետք է զգույշ լինել, որպեսզի չվնասվի կամ չգրգռվի հարակից սկավառակները: Քանի որ ներթափանցման խորությունը պետք է վերահսկվի՝ կայուն և վերարտադրելի արդյունքներ ստանալու համար, մենք ձեռքով պատրաստեցինք խցան՝ կտրելով 3 մմ երկարությամբ ասեղի պատյանը: Այս խցանի օգտագործումը ապահովում է ողնաշարի մարմնում միատարր հորատման խորություն: Նախնական փորձարկումների ժամանակ վիրահատությանը մասնակցած երեք օրթոպեդ վիրաբույժներ պարզեցին, որ 16 տրամաչափի ասեղներով աշխատելն ավելի հեշտ է, քան 18 տրամաչափի ասեղներով կամ այլ մեթոդներով: Հորատման ընթացքում չափազանց արյունահոսությունից խուսափելու համար ասեղը որոշ ժամանակ անշարժ պահելը կապահովի ավելի հարմար ներդրման անցք, ինչը ենթադրում է, որ այս կերպ կարելի է վերահսկել MC-ի որոշակի աստիճան:
Չնայած բազմաթիվ ուսումնասիրություններ ուղղված են եղել MC-ին, քիչ բան է հայտնի MC25,26,27-ի պատճառաբանության և պաթոգենեզի մասին: Մեր նախորդ ուսումնասիրությունների հիման վրա մենք պարզեցինք, որ աուտոիմունիտետը կարևոր դեր է խաղում MC12-ի առաջացման և զարգացման մեջ: Այս ուսումնասիրությունը ուսումնասիրել է IL-4, IL-17 և IFN-γ-ի քանակական արտահայտությունը, որոնք CD4+ բջիջների հիմնական դիֆերենցման ուղիներն են հակածինային խթանումից հետո: Մեր ուսումնասիրության մեջ, բացասական խմբի համեմատ, NPE խումբն ուներ IL-4, IL-17 և IFN-γ-ի ավելի բարձր արտահայտությունը, և IL-4-ի և IL-17-ի սպիտակուցային մակարդակները նույնպես ավելի բարձր էին:
Կլինիկորեն, IL-17 mRNA-ի արտահայտությունը մեծացած է սկավառակի ճողվածքով հիվանդների NP բջիջներում28: IL-4-ի և IFN-γ-ի արտահայտման մակարդակների բարձրացում հայտնաբերվել է նաև սկավառակի ճողվածքի սուր ոչ սեղմող մոդելում՝ համեմատած առողջ վերահսկիչ խմբի հետ29: IL-17-ը կարևոր դեր է խաղում բորբոքման, հյուսվածքների վնասվածքի մեջ աուտոիմուն հիվանդությունների դեպքում30 և ուժեղացնում է IFN-γ31-ի նկատմամբ իմունային պատասխանը: IL-17-ի միջնորդությամբ հյուսվածքների վնասվածքի ուժեղացում է գրանցվել MRL/lpr մկների32 և աուտոիմունիտետի նկատմամբ զգայուն մկների33 մոտ: IL-4-ը կարող է արգելակել պրո-բորբոքային ցիտոկինների (օրինակ՝ IL-1β և TNFα) արտահայտությունը և մակրոֆագերի ակտիվացումը34: Հաղորդվել է, որ IL-4-ի mRNA արտահայտությունը տարբեր էր NPE խմբում՝ համեմատած IL-17-ի և IFN-γ-ի հետ նույն ժամանակահատվածում. IFN-γ-ի mRNA արտահայտությունը NPE խմբում զգալիորեն ավելի բարձր էր, քան մյուս խմբերում: Հետևաբար, IFN-γ արտադրությունը կարող է լինել NP ինտերկալացիայի կողմից առաջացած բորբոքային պատասխանի միջնորդ: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ IFN-γ-ն արտադրվում է բազմաթիվ բջիջների կողմից, այդ թվում՝ ակտիվացված 1-ին տիպի T օգնական բջիջների, բնական մարդասպան բջիջների և մակրոֆագերի կողմից35,36, և հանդիսանում է իմունային պատասխանները խթանող հիմնական պրոբորբոքային ցիտոկին37:
Այս ուսումնասիրությունը ենթադրում է, որ աուտոիմունային պատասխանը կարող է ներգրավված լինել MC-ի առաջացման և զարգացման մեջ: Լուոման և այլք պարզել են, որ MC-ի և ակնառու նանոմասնիկների ազդանշանային բնութագրերը նման են ՄՌՏ-ի վրա, և երկուսն էլ ցույց են տալիս բարձր ազդանշան T2W հաջորդականության մեջ38: Հաստատվել է, որ որոշ ցիտոկիններ, ինչպիսիք են IL-139-ը, սերտորեն կապված են MC-ի առաջացման հետ: Մա-ն և այլք ենթադրել են, որ նանոմասնիկների վերև կամ ներքև ելուստը կարող է մեծ ազդեցություն ունենալ MC12-ի առաջացման և զարգացման վրա: Բոբեչկոն40 և Հերցբեյնը և այլք41 հայտնել են, որ նանոմասնիկները իմունոտոլերանտ հյուսվածք են, որը չի կարող մտնել անոթային շրջանառություն ծննդյան պահից: Նանոմասնիկների ելուստները օտար մարմիններ են մտցնում արյան մատակարարման մեջ, այդպիսով միջնորդելով տեղային աուտոիմունային ռեակցիաները42: Աուտոիմունային ռեակցիաները կարող են առաջացնել մեծ թվով իմունային գործոններ, և երբ այս գործոնները անընդհատ ենթարկվում են հյուսվածքներին, դրանք կարող են առաջացնել ազդանշանային փոփոխությունների43: Այս ուսումնասիրության մեջ IL-4-ի, IL-17-ի և IFN-γ-ի գերարտահայտումը բնորոշ իմունային գործոններ են, ինչը ևս մեկ անգամ ապացուցում է նանոմասնիկների և MC-ների միջև սերտ կապը44: Այս կենդանական մոդելը լավ ընդօրինակում է նանոմասնիկների ճեղքումը և ծայրային թիթեղի մուտքը։ Այս գործընթացը հետագայում բացահայտեց աուտոիմունիտետի ազդեցությունը MC-ի վրա։
Ինչպես և սպասվում էր, այս կենդանական մոդելը մեզ հնարավորություն է տալիս ուսումնասիրելու ողնաշարի միջողնային սկավառակները (MC): Այնուամենայնիվ, այս մոդելը դեռևս ունի որոշ սահմանափակումներ. նախ, կենդանիների դիտարկման փուլում որոշ միջանկյալ փուլի նապաստակներ պետք է էվթանազիայի ենթարկվեն հյուսվածաբանական և մոլեկուլային կենսաբանության թեստավորման համար, ուստի որոշ կենդանիներ ժամանակի ընթացքում «դուրս են գալիս օգտագործումից»: Երկրորդ, չնայած այս ուսումնասիրության մեջ սահմանված են երեք ժամանակային կետեր, ցավոք, մենք մոդելավորել ենք MC-ի միայն մեկ տեսակ (Մոդիկի I տիպի փոփոխություն), ուստի դա բավարար չէ մարդու հիվանդության զարգացման գործընթացը ներկայացնելու համար, և անհրաժեշտ է սահմանել ավելի շատ ժամանակային կետեր՝ բոլոր ազդանշանային փոփոխությունները ավելի լավ դիտարկելու համար: Երրորդ, հյուսվածքների կառուցվածքի փոփոխությունները իսկապես կարող են հստակ ցույց տրվել հյուսվածաբանական ներկման միջոցով, բայց որոշ մասնագիտացված տեխնիկաներ կարող են ավելի լավ բացահայտել այս մոդելի միկրոկառուցվածքային փոփոխությունները: Օրինակ, բևեռացված լույսի մանրադիտակն օգտագործվել է նապաստակի միջողնային սկավառակներում ֆիբրոկրարտիլյացիայի ձևավորումը վերլուծելու համար45: ՆՊ-ի երկարատև ազդեցությունը MC-ի և ծայրային թիթեղի վրա պահանջում է հետագա ուսումնասիրություն:
Նոր Զելանդիայի հիսունչորս արու սպիտակ ճագարներ (մոտ 2.5-3 կգ քաշով, 3-3.5 ամսական տարիքով) պատահականորեն բաժանվել են կեղծ վիրահատության խմբի, մկանների իմպլանտացիայի խմբի (ME խումբ) և նյարդային արմատի իմպլանտացիայի խմբի (NPE խումբ): Բոլոր փորձարարական ընթացակարգերը հաստատվել են Տյանցզինի հիվանդանոցի էթիկայի կոմիտեի կողմից, և փորձարարական մեթոդները իրականացվել են հաստատված ուղեցույցներին խստորեն համապատասխան:
Ս. Սոբաջիմայի 46 վիրաբուժական տեխնիկայում որոշակի բարելավումներ են կատարվել: Յուրաքանչյուր ճագար տեղադրվել է կողմնային պառկած դիրքում, և հինգ հաջորդական գոտկային միջողնային սկավառակների (ԵՄՍ) առաջային մակերեսը բացվել է հետին կողմնային հետորովայնամզային մոտեցմամբ: Յուրաքանչյուր ճագարի տրվել է ընդհանուր անզգայացում (20% ուրեթան, 5 մլ/կգ ականջի երակի միջոցով): Կողերի ստորին եզրից մինչև կոնքի եզրը կատարվել է երկայնական մաշկի կտրվածք, պարավերտեբրալ մկաններից 2 սմ որովայնային ուղղությամբ: L1-ից մինչև L6 աջ առաջային կողմնային ողնաշարը բացվել է վերին ենթամաշկային հյուսվածքի, հետորովայնամզային հյուսվածքի և մկանների սուր և բութ դիսեկցիայի միջոցով (Նկար 6Ա): Սկավառակի մակարդակը որոշվել է կոնքի եզրը որպես L5-L6 սկավառակի մակարդակի անատոմիական նշագիծ օգտագործելով: Օգտագործեք 16 տրամաչափի պունկցիոն ասեղ՝ L5 ողի ծայրային թիթեղի մոտ 3 մմ խորությամբ անցք բացելու համար (Նկար 6Բ): 5 մլ ներարկիչով արտածծեք L1-L2 միջողնային սկավառակի ինքնածին պուլպոզային կորիզը (Նկ. 6C): Հեռացրեք պուլպոզային կորիզը կամ մկանը՝ յուրաքանչյուր խմբի պահանջներին համապատասխան: Հորատման անցքը խորացնելուց հետո, խորը ֆասցիայի, մակերեսային ֆասցիայի և մաշկի վրա տեղադրվում են կլանվող կարեր՝ զգուշանալով վիրահատության ընթացքում չվնասել ողնաշարի մարմնի պերիոստեալ հյուսվածքը:
(Ա) L5-L6 սկավառակը բացվում է հետին-կողային հետորովայնամզային մոտեցմամբ։ (Բ) Օգտագործվում է 16 տրամաչափի ասեղ՝ L5 ծայրային թիթեղի մոտ անցք բացելու համար։ (Գ) Աուտոլոգիական MF-ները հավաքվում են։
Ընդհանուր անզգայացումը կատարվել է ականջի երակի միջոցով ներարկված 20% ուրեթանով (5 մլ/կգ), իսկ գոտկային ողնաշարի ռենտգենագրությունը կրկնվել է վիրահատությունից 12, 16 և 20 շաբաթ անց։
Վիրահատությունից 12, 16 և 20 շաբաթ անց ճագարները զոհաբերվել են կետամինի (25.0 մգ/կգ) միջմկանային և նատրիումի պենտոբարբիտալի (1.2 գ/կգ) ներերակային ներարկումների միջոցով։ Հյուսվածաբանական վերլուծության համար հեռացվել է ամբողջ ողնաշարը, և կատարվել է իրական վերլուծություն։ Իմունային գործոնների փոփոխությունները հայտնաբերելու համար օգտագործվել են քանակական հակադարձ տրանսկրիպցիա (RT-qPCR) և Western blotting մեթոդները։
Ճագարների մոտ ՄՌՏ հետազոտությունները կատարվել են 3.0 T կլինիկական մագնիսով (GE Medical Systems, Florence, SC), որը հագեցած է վերջույթների օրթոգոնալ կծիկ ընդունիչով: Ճագարները անզգայացվել են 20% ուրեթանով (5 մլ/կգ) ականջի երակի միջոցով, ապա տեղադրվել են մագնիսի մեջ՝ գոտկային շրջանը կենտրոնացնելով 5 դյույմ տրամագծով շրջանաձև մակերեսային կծիկի վրա (GE Medical Systems): Ստացվել են պսակաձև T2-կշռված տեղորոշիչ պատկերներ (TR, 1445 մվ; TE, 37 մվ)՝ գոտկային սկավառակի տեղակայումը L3-L4-ից մինչև L5-L6 սահմաններում որոշելու համար: Ստացվել են սագիտալ հարթության T2-կշռված կտորներ հետևյալ կարգավորումներով՝ արագ սպին-էխո հաջորդականություն՝ 2200 մվ կրկնության ժամանակով (TR) և 70 մվ արձագանքի ժամանակով (TE), մատրից; 260 տեսողական դաշտ և ութ խթան; կտրվածքի հաստությունը 2 մմ էր, բացը՝ 0.2 մմ:
Վերջին լուսանկարը արվելուց և վերջին նապաստակի սպանությունից հետո, կեղծ, մկաններում ներկառուցված և նապաստակային սկավառակները հանվել են հյուսվածաբանական հետազոտության համար: Հյուսվածքները ֆիքսվել են 10% չեզոք բուֆերային ֆորմալինի մեջ 1 շաբաթ, ապակալցիֆիկացվել են էթիլենդիամինտետրաքացախաթթվով և կտրվել են պարաֆինով: Հյուսվածքային բլոկները ներդրվել են պարաֆինի մեջ և կտրվել են սագիտալ հատվածների (5 մկմ հաստությամբ)՝ օգտագործելով միկրոտոմ: Կտրվածքները ներկվել են հեմատոքսիլինով և էոզինով (H&E):
Յուրաքանչյուր խմբի ճագարներից միջողնային սկավառակները հավաքելուց հետո, արտադրողի հրահանգներին և ImProm II հակադարձ տրանսկրիպցիայի համակարգին (Promega Inc., Մեդիսոն, Վիսկոնսին, ԱՄՆ) համապատասխան, ընդհանուր ՌՆԹ-ն արդյունահանվել է UNIQ-10 սյան (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Չինաստան) միջոցով: Կատարվել է հակադարձ տրանսկրիպցիա:
RT-qPCR-ը կատարվել է Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ԱՄՆ) և SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Սենթ Լուիս, Միսսուրի, ԱՄՆ) սարքի միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: ՊՇՌ ռեակցիայի ծավալը կազմել է 20 մկլ և պարունակում է 1.5 մկլ նոսրացված կԴՆԹ և յուրաքանչյուր պրայմերից 0.2 մկՄ: Պրայմերները նախագծվել են OligoPerfect Designer (Invitrogen, Վալենսիա, Կալիֆոռնիա) ընկերության կողմից և արտադրվել են Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Չինաստան) ընկերության կողմից (աղյուսակ 1): Օգտագործվել են հետևյալ ջերմային ցիկլավորման պայմանները՝ պոլիմերազի սկզբնական ակտիվացման փուլ 94°C ջերմաստիճանում՝ 2 րոպե, այնուհետև 40 ցիկլ՝ յուրաքանչյուրը 15 վայրկյան 94°C ջերմաստիճանում՝ ձևանմուշի դենատուրացիայի համար, 1 րոպե՝ թրծում 60°C ջերմաստիճանում, երկարացում և ֆլուորեսցենցիա: Չափումները կատարվել են 1 րոպե 72°C ջերմաստիճանում: Բոլոր նմուշները ուժեղացվել են երեք անգամ, և միջին արժեքը օգտագործվել է RT-qPCR վերլուծության համար: Ամպլիֆիկացիայի տվյալները վերլուծվել են FlexStation 3-ի միջոցով (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ԱՄՆ): IL-4, IL-17 և IFN-γ գեների արտահայտությունը նորմալացվել է էնդոգեն վերահսկողության (ACTB) նկատմամբ: Թիրախային mRNA-ի հարաբերական արտահայտման մակարդակները հաշվարկվել են 2-ΔΔCT մեթոդով:
Ընդհանուր սպիտակուցը հյուսվածքներից արդյունահանվել է հյուսվածքային հոմոգենիզատորի միջոցով RIPA լիզիսի բուֆերում (պարունակում է պրոտեազի և ֆոսֆատազի ինհիբիտորների կոկտեյլ), այնուհետև ցենտրիֆուգացվել է 13,000 պտ/րոպե արագությամբ 20 րոպե 4°C ջերմաստիճանում՝ հյուսվածքային մնացորդները հեռացնելու համար: Յուրաքանչյուր շերտում լցվել է սպիտակուցի հիսուն միկրոգրամ, բաժանվել 10% SDS-PAGE-ով, այնուհետև տեղափոխվել PVDF թաղանթի մեջ: Բլոկավորումը կատարվել է 5% յուղազուրկ չոր կաթում՝ Tris-բուֆերային աղային լուծույթում (TBS), որը պարունակում է 0.1% Tween 20, 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում: Թաղանթը ինկուբացվել է ճագարի հակադեկորինային առաջնային հակամարմնի հետ (նոսրացված 1:200; Բոստեր, Ուհան, Չինաստան) (նոսրացված 1:200; Բիոս, Պեկին, Չինաստան) գիշերը 4°C ջերմաստիճանում և ռեակցիայի մեջ է մտել երկրորդ օրը: Երկրորդային հակամարմնով (այծի հակա-նապաստակի իմունոգլոբուլին G՝ 1:40,000 նոսրացմամբ)՝ համակցված ձիու պերօքսիդազի (Բոստեր, Ուհան, Չինաստան) հետ 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում: Western blot ազդանշանները հայտնաբերվել են քեմիլյումինեսցենտային թաղանթի վրա քեմիլյումինեսցենցիայի ավելացման միջոցով՝ ռենտգենյան ճառագայթումից հետո: Դենսիտոմետրիկ վերլուծության համար բլոտները սկանավորվել և քանակականացվել են BandScan ծրագրի միջոցով, և արդյունքները արտահայտվել են որպես թիրախային գենի իմունառեակտիվության և տուբուլինի իմունառեակտիվության հարաբերակցություն:
Վիճակագրական հաշվարկները կատարվել են SPSS16.0 ծրագրային փաթեթի միջոցով (SPSS, ԱՄՆ): Ուսումնասիրության ընթացքում հավաքված տվյալները արտահայտվել են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում (միջին ± ստանդարտ շեղում) և վերլուծվել են միակողմանի կրկնվող չափումների դիսպերսիայի վերլուծության (ANOVA) միջոցով՝ երկու խմբերի միջև տարբերությունները որոշելու համար: P < 0.05-ը համարվել է վիճակագրորեն նշանակալի:
Այսպիսով, ոսկրածուծի կենդանական մոդելի ստեղծումը՝ ողնաշարի մարմնում ինքնածին նանոմասնիկներ տեղադրելով և մակրոանատոմիական դիտարկում, ՄՌՏ վերլուծություն, հյուսվածաբանական գնահատում և մոլեկուլային կենսաբանական վերլուծություն կատարելով, կարող է կարևոր գործիք դառնալ մարդու ոսկրածուծի մեխանիզմները գնահատելու և հասկանալու, ինչպես նաև նոր թերապևտիկ միջամտություններ մշակելու համար։
Ինչպես մեջբերել այս հոդվածը. Հան, Ս. և այլք: Մոդիկի փոփոխությունների կենդանական մոդելը ստեղծվել է գոտկային ողնաշարի ենթախոնդրալ ոսկորի մեջ ինքնածին պուլպոսուսային միջուկի իմպլանտացիայի միջոցով: Գիտ. Հայտարարություն 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016):
Վեյշաուպտ, Դ., Զանետտի, Մ., Հոդլեր, Ջ., և Բուս, Ն.: Ողնաշարի գոտկային հատվածի մագնիսական ռեզոնանսային պատկերացում. սկավառակի ճողվածքի և պահպանման, նյարդարմատի սեղմման, ծայրային թիթեղների անոմալիաների և ֆասետային հոդերի օստեոարթրիտի տարածվածությունը ասիմպտոմատիկ կամավորների մոտ: rate. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998):
Կյաեր, Պ., Կորշհոլմ, Լ., Բենդիքս, Տ., Սորենսեն, Ջ.Ս., և Լեբեուֆ-Իդ, Կ. Մոդիչի փոփոխությունները և դրանց կապը կլինիկական արդյունքների հետ: Եվրոպական ողնաշարի ամսագիր. Եվրոպական ողնաշարի ընկերության, ողնաշարի դեֆորմացիայի եվրոպական ընկերության և պարանոցային ողնաշարի հետազոտությունների եվրոպական ընկերության պաշտոնական հրատարակություն 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006):
Կուիսմա, Մ. և այլք։ Մոդիկի փոփոխություններ գոտկային ողնաշարի ծայրային թիթեղներում. տարածվածությունը և կապը մեջքի ստորին հատվածի ցավի և իշիասի հետ միջին տարիքի տղամարդ աշխատողների մոտ։ Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007)։
դե Ռուս, Ա., Կրեսել, Հ., Սպրիցեր, Կ., և Դալինկա, Մ. Ոսկրածուծի փոփոխությունների ՄՌՏ հետազոտություն՝ գոտկային ողնաշարի դեգեներատիվ հիվանդության դեպքում։ AJR։ Ամերիկյան ռադիոլոգիայի հանդես 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987)։
Մոդիկ, ՄՏ, Ստեյնբերգ, ՊՄ, Ռոս, ՋՍ, Մասարիկ, ԹՋ, և Քարթեր, ՋՌ։ Դեգեներատիվ սկավառակի հիվանդություն. ողնուղեղի փոփոխությունների գնահատում ՄՌՏ-ի միջոցով։ Ռադիոլոգիա 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988)։
Մոդիչ, Մ.Թ., Մասարիկ, Թ.Ջ., Ռոս, Ջ.Ս. և Քարթեր, Ջ.Ռ. Դեգեներատիվ սկավառակի հիվանդության պատկերագրություն։ Ռադիոլոգիա 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988)։
Ջենսեն, Տ.Ս. և այլք։ Նեովերտեբրալ ծայրային թիթեղի (Մոդիկ) կանխատեսող գործոնները ազդանշանային փոփոխությունների ազդանշան են տալիս ընդհանուր բնակչության շրջանում։ Եվրոպական ողնաշարի ամսագիր. Եվրոպական ողնաշարի ընկերության, ողնաշարի դեֆորմացիայի եվրոպական ընկերության և պարանոցային ողնաշարի հետազոտությունների եվրոպական ընկերության պաշտոնական հրատարակություն, բաժին 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010)։
Ալբերտ, Հ.Բ. և Մաննիշ, Կ. Մոդիչի փոփոխությունները գոտկային սկավառակի ճողվածքից հետո: Եվրոպական ողնաշարի ամսագիր. Եվրոպական ողնաշարի ընկերության, ողնաշարի դեֆորմացիայի եվրոպական ընկերության և պարանոցային ողնաշարի հետազոտությունների եվրոպական ընկերության պաշտոնական հրատարակություն 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007):
Կերտուլա, Լ., Լուոմա, Կ., Վեհմաս, Տ., Գրոնբլադ, Մ., և Կաապա, Ե. Մոդիկի I տիպի փոփոխությունները կարող են կանխատեսել արագ զարգացող դեֆորմացիոն սկավառակի դեգեներացիա. 1 տարվա հեռանկարային ուսումնասիրություն: Եվրոպական ողնաշարի հանդես 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012):
Հու, ԶՋ, Չժաո, ՖԴ, Ֆանգ, ՇՔ և Ֆան, ՍՎ Մոդիկի փոփոխություններ. հնարավոր պատճառները և գոտկային սկավառակի դեգեներացիայի նպաստը: Բժշկական վարկածներ 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009):
Կրոկ, Հ.Վ. Ներքին սկավառակի պատռվածք։ Սկավառակի պրոլապսի խնդիրներ 50 տարեկանից բարձր։ Ողնաշար (Ֆիլա, Փենսիլվանիա 1976) 11, 650–653 (1986)։