Արծաթի նիտրատով վիրակապերի հակաբիոթաղանթային ազդեցություն և ապաքինման խթանում

Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի CSS-ի սահմանափակ աջակցություն: Լավագույն արդյունքի հասնելու համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել ձեր դիտարկիչի ավելի նոր տարբերակ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչ այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճավորման կամ JavaScript-ի:
Վերքերի մեջ մանրէների աճը հաճախ դրսևորվում է բիոթաղանթների տեսքով, որոնք խանգարում են ապաքինմանը և դժվար է վերացնել: Նոր արծաթե վիրակապերը պնդում են, որ պայքարում են վերքերի վարակների դեմ, սակայն դրանց հակաբիոթաղանթային արդյունավետությունը և վարակից անկախ ապաքինման ազդեցությունը ընդհանուր առմամբ անհայտ է: Օգտագործելով Staphylococcus aureus-ի և Pseudomonas aeruginosa-ի in vitro և in vivo բիոթաղանթային մոդելներ, մենք ներկայացնում ենք Ag1+ իոն առաջացնող վիրակապերի արդյունավետությունը. Ag1+ վիրակապեր, որոնք պարունակում են էթիլենդիամինտետրաքացախաթթու և բենզեթոնիումի քլորիդ (Ag1+/EDTA/BC), և արծաթի նիտրատ պարունակող վիրակապեր (Ag oxysalts): , որոնք արտադրում են Ag1+, Ag2+ և Ag3+ իոններ՝ վերքի բիոթաղանթի և դրա ապաքինման վրա ազդեցության դեմ պայքարելու համար: Ag1+ վիրակապերը նվազագույն ազդեցություն են ունեցել վերքի բիոթաղանթի վրա in vitro և մկների մոտ (C57BL/6j): Ի տարբերություն դրա, թթվածնով հարստացված Ag աղերը և Ag1+/EDTA/BC վիրակապերը զգալիորեն նվազեցրել են կենսունակ բակտերիաների քանակը բիոթաղանթներում in vitro և ցույց են տվել մանրէային և EPS բաղադրիչների զգալի նվազում մկների վերքերի բիոթաղանթներում: Այս վիրակապերը տարբեր ազդեցություն են ունեցել բիոթաղանթով վարակված և ոչ բիոթաղանթով վարակված վերքերի ապաքինման վրա, ընդ որում՝ թթվածնով հարստացված աղային վիրակապերը ավելի օգտակար ազդեցություն են ունեցել վերէպիթելիզացիայի, վերքի չափի և բորբոքման վրա՝ համեմատած վերահսկիչ բուժման և այլ արծաթե վիրակապերի հետ։ Արծաթե վիրակապերի տարբեր ֆիզիկաքիմիական հատկությունները կարող են տարբեր ազդեցություն ունենալ վերքի բիոթաղանթի և ապաքինման վրա, և սա պետք է հաշվի առնել բիոթաղանթով վարակված վերքերի բուժման համար վիրակապ ընտրելիս։
Քրոնիկ վերքերը սահմանվում են որպես «վերքեր, որոնք չեն կարողանում անցնել ապաքինման բնականոն փուլերով կանոնավոր և ժամանակին»1: Քրոնիկ վերքերը հոգեբանական, սոցիալական և տնտեսական բեռ են ստեղծում հիվանդների և առողջապահական համակարգի համար: 2017–182 թվականներին վերքերի և դրանց հետ կապված ուղեկցող հիվանդությունների բուժման համար NHS-ի տարեկան ծախսերը գնահատվում են 8.3 միլիարդ ֆունտ ստեռլինգ: Քրոնիկ վերքերը ներկայումս նույնպես հրատապ խնդիր են Միացյալ Նահանգներում, որտեղ Medicare-ը վերքերով հիվանդների բուժման տարեկան արժեքը գնահատում է 28.1–96.8 միլիարդ դոլար3:
Վարակը վերքերի լավացումը կանխող հիմնական գործոն է: Վարակները հաճախ դրսևորվում են բիոթաղանթների տեսքով, որոնք առկա են չբուժվող քրոնիկ վերքերի 78%-ում: Կենսաթաղանթները ձևավորվում են, երբ միկրոօրգանիզմները անդառնալիորեն կպչում են մակերեսներին, ինչպիսիք են վերքերի մակերեսները, և կարող են ագրեգացվել՝ ձևավորելով արտաբջջային պոլիմեր (EPS) արտադրող համակեցություններ: Վերքի բիոթաղանթը կապված է բորբոքային ռեակցիայի աճի հետ, որը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասման, որը կարող է հետաձգել կամ կանխել լավացումը4: Հյուսվածքների վնասման աճը կարող է մասամբ պայմանավորված լինել մատրիցային մետաղոպրոտեինազների, կոլագենազի, էլաստազի և ռեակտիվ թթվածնային տեսակների ակտիվության աճով5: Ավելին, բորբոքային բջիջներն ու բիոթաղանթները իրենք թթվածնի մեծ սպառողներ են և, հետևաբար, կարող են առաջացնել տեղային հյուսվածքային հիպօքսիա՝ զրկելով բջիջներին հյուսվածքների արդյունավետ վերականգնման համար անհրաժեշտ կենսական թթվածնից6:
Հասուն բիոթաղանթները բարձր կայունություն ունեն հակամանրէային նյութերի նկատմամբ, ինչը պահանջում է ագրեսիվ ռազմավարություններ բիոթաղանթի վարակների վերահսկման համար, ինչպիսիք են մեխանիկական մշակումը, որին հաջորդում է արդյունավետ հակամանրէային բուժումը: Քանի որ բիոթաղանթները կարող են արագ վերականգնվել, արդյունավետ հակամանրէային միջոցները կարող են նվազեցնել վիրաբուժական մաքրումից հետո վերաֆորմացիայի ռիսկը7:
Արծաթը ավելի ու ավելի է օգտագործվում հակամանրէային վիրակապերի մեջ և հաճախ օգտագործվում է որպես քրոնիկ վարակված վերքերի առաջին գծի բուժում: Կան բազմաթիվ առևտրային արծաթե վիրակապեր, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է արծաթի տարբեր կազմ, կոնցենտրացիա և հիմքային մատրից: Արծաթե թևկապերի ոլորտում առաջընթացը հանգեցրել է նոր արծաթե թևկապերի մշակմանը: Արծաթի մետաղական ձևը (Ag0) իներտ է. հակամանրէային արդյունավետության հասնելու համար այն պետք է կորցնի մեկ էլեկտրոն՝ իոնային արծաթ (Ag1+) առաջացնելու համար: Ավանդական արծաթե վիրակապերը պարունակում են արծաթե միացություններ կամ մետաղական արծաթ, որոնք հեղուկի ազդեցության տակ քայքայվում են՝ առաջացնելով Ag1+ իոններ: Այս Ag1+ իոնները ռեակցիայի մեջ են մտնում մանրէային բջջի հետ՝ հեռացնելով էլեկտրոնները կառուցվածքային բաղադրիչներից կամ գոյատևման համար անհրաժեշտ կարևոր գործընթացներից: Արտոնագրված տեխնոլոգիան հանգեցրել է արծաթե նոր միացության՝ Ag օքսիաղերի (արծաթի նիտրատ, Ag7NO11) մշակմանը, որը ներառված է վերքերի վիրակապերի մեջ: Ավանդական արծաթից տարբերվող թթվածին պարունակող աղերի քայքայումը առաջացնում է արծաթի ավելի բարձր վալենտային վիճակներ (Ag1+, Ag2+ և Ag3+): Ին վիտրո ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ թթվածնով հարուստ արծաթի աղերի ցածր կոնցենտրացիաները ավելի արդյունավետ են, քան միաիոնային արծաթը (Ag1+) պաթոգեն բակտերիաների, ինչպիսիք են Pseudomonas aeruginosa-ն, Staphylococcus aureus-ը և Escherichia coli-ն, դեմ պայքարում8,9: Արծաթե վիրակապերի մեկ այլ նոր տեսակ ներառում է լրացուցիչ բաղադրիչներ, մասնավորապես՝ էթիլենդիամինտետրաքացախաթթու (EDTA) և բենզեթոնիումի քլորիդ (BC), որոնք, ինչպես հաղորդվում է, թիրախավորում են բիոթաղանթային EPS-ը և դրանով իսկ մեծացնում արծաթի ներթափանցումը բիոթաղանթի մեջ: Այս նոր արծաթե տեխնոլոգիաները առաջարկում են վերքի բիոթաղանթները թիրախավորելու նոր եղանակներ: Այնուամենայնիվ, այս հակամանրէային միջոցների ազդեցությունը վերքի միջավայրի և վարակից անկախ ապաքինման վրա կարևոր է՝ ապահովելու համար, որ դրանք չստեղծեն անբարենպաստ վերքի միջավայր կամ չհետաձգեն ապաքինումը: Արծաթե մի քանի վիրակապերի դեպքում մտավախություններ են հայտնվել ին վիտրո արծաթի ցիտոտոքսիկության վերաբերյալ10,11: Այնուամենայնիվ, ին վիտրո ցիտոտոքսիկությունը դեռևս չի վերածվել ին վիվո թունավորության, և մի քանի Ag1+ վիրակապեր ցույց են տվել լավ անվտանգության պրոֆիլ12:
Այստեղ մենք ուսումնասիրել ենք նորարարական արծաթե բանաձևեր պարունակող կարբօքսիմեթիլցելյուլոզային վիրակապերի արդյունավետությունը վերքի բիոթաղանթի դեմ in vitro և in vivo պայմաններում: Բացի այդ, գնահատվել է այս վիրակապերի ազդեցությունը իմունային պատասխանների և վարակից անկախ ապաքինման վրա:
Բոլոր օգտագործված վիրակապերը առևտրային առումով մատչելի էին: 3M Kerracel գելային մանրաթելային վիրակապը (3M, Նաթսֆորդ, Մեծ Բրիտանիա) ոչ հակամանրէային 100% կարբօքսիմեթիլցելյուլոզային (CMC) գելային մանրաթելային վիրակապ է, որն օգտագործվել է որպես վերահսկիչ վիրակապ այս ուսումնասիրության մեջ: Գնահատվել են երեք հակամանրէային CMC արծաթե վիրակապեր, մասնավորապես՝ 3M Kerracel Ag վիրակապը (3M, Նաթսֆորդ, Մեծ Բրիտանիա), որը պարունակում է 1.7 զանգվածային% թթվածնացված արծաթի աղ (Ag7NO11) բարձր վալենտային արծաթի իոններում (Ag1+, Ag2+ և Ag3+): Ag7NO11-ի քայքայման ընթացքում առաջանում են Ag1+, Ag2+ և Ag3+ իոններ 1:2:4 հարաբերակցությամբ: Aquacel Ag Extra վիրակապ, որը պարունակում է 1.2% արծաթի քլորիդ (Ag1+) (ConvaTec, Դիսայդ, Մեծ Բրիտանիա) 13 և Aquacel Ag + Extra վիրակապ, որը պարունակում է 1.2% արծաթի քլորիդ (Ag1+), EDTA և բենզեթոնիումի քլորիդ (ConvaTec, Դիսայդ, Մեծ Բրիտանիա) 14։
Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված շտամներն էին Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Անգլիայի հանրային առողջապահություն, Սոլսբերի) և Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Անգլիայի հանրային առողջապահություն, Սոլսբերի):
Բակտերիաները գիշերը աճեցվել են Մյուլլեր-Հինտոնի արգանակում (Oxoid, Altrincham, Մեծ Բրիտանիա): Այնուհետև գիշերը մշակված կուլտուրան նոսրացվել է 1:100 հարաբերակցությամբ Մյուլլեր-Հինտոնի արգանակում և 200 մկլ տեղադրվել է ստերիլ 0.2 մկմ Ուոթմանի ցիկլոպորային թաղանթների (Whatman plc, Maidstone, Մեծ Բրիտանիա) և Մյուլլեր-Հինտոնի ագարի թիթեղների (Sigma-Aldrich Company Ltd, Քենթ, Մեծ Բրիտանիա) վրա: Գաղութային կենսաթաղանթների առաջացում 37°C ջերմաստիճանում 24 ժամ: Այս գաղութային կենսաթաղանթները ստուգվել են լոգարիթմական կծկման համար:
Վիրակապը կտրեք 3 սմ2 քառակուսի կտորների և նախապես խոնավացրեք ստերիլ ապաիոնացված ջրով: Վիրակապը դրեք ագարի ափսեի վրա գտնվող գաղութի կենսաթաղանթի վրա: Կենսաթաղանթի յուրաքանչյուր 24 հա-ն հեռացվեց, և կենսաթաղանթի ներսում կենսունակ մանրէները (CFU/մլ) քանակականացվեցին Day-Angle չեզոքացման արգանակում (Merck-Millipore) հաջորդական նոսրացման միջոցով (10−1-ից մինչև 10−7): 37°C-ում 24 ժամ ինկուբացիայից հետո, ստանդարտ ափսեների հաշվարկներ կատարվեցին Մյուլլեր-Հինտոնի ագարի ափսեների վրա: Յուրաքանչյուր մշակում և ժամանակային կետ կատարվեց եռակի, և ափսեների հաշվարկը կրկնվեց յուրաքանչյուր նոսրացման համար:
Խոզի փորի կաշի ստացվում է խոշոր սպիտակ էգ խոզերից՝ մորթից հետո 15 րոպեի ընթացքում՝ համաձայն Եվրամիության արտահանման ստանդարտների: Կաշի սափրվել և մաքրվել է սպիրտային անձեռոցիկներով, ապա սառեցվել է -80°C ջերմաստիճանում 24 ժամ՝ մաշկը թուլացնելու համար: Հալեցնելուց հետո 1 սմ2 մաշկի կտորները լվացվել են երեք անգամ PBS-ով, 0.6% նատրիումի հիպոքլորիտով և 70% էթանոլով՝ յուրաքանչյուր անգամ 20 րոպե: Մաշկը հեռացնելուց առաջ մնացած էթանոլը հեռացրեք՝ 3 անգամ լվանալով ստերիլ PBS-ով: Կաշի կուլտիվացվել է 6 փոսիկով ափսեի մեջ՝ վերևում տեղադրված 0.45 մկմ հաստությամբ նեյլոնե թաղանթով (Merck-Millipore) և 3 կլանող բարձիկներով (Merck-Millipore), որոնք պարունակում են 3 մլ ֆետալ խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկ (Sigma), որը լրացված է 10% Dulbecco-ի մոդիֆիկացված Eagle միջավայրով (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.):
Գաղութային բիոթաղանթները աճեցվել են բիոթաղանթի ազդեցության ուսումնասիրությունների համար նկարագրված եղանակով: Բիոթաղանթը թաղանթի վրա 72 ժամ կուլտիվացնելուց հետո, բիոթաղանթը մաշկի մակերեսին քսվել է ստերիլ պատվաստման օղակի միջոցով, և թաղանթը հեռացվել է: Այնուհետև բիոթաղանթը խոզի մաշկի վրա ինկուբացվել է ևս 24 ժամ 37°C ջերմաստիճանում, որպեսզի բիոթաղանթը հասունանա և կպչի խոզի մաշկին: Բիոթաղանթի հասունացումից և կպչելուց հետո, ստերիլ թորած ջրով նախապես թրջված 1.5 սմ2 վիրակապը անմիջապես քսվել է մաշկի մակերեսին և ինկուբացվել է 37°C ջերմաստիճանում 24 ժամ: Կենսունակ մանրէները տեսանելի են դարձել ներկման միջոցով՝ յուրաքանչյուր էքսպլանտի գագաթային մակերեսին միատարր կերպով PrestoBlue բջջային կենսունակության ռեակտիվը (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) քսելով և այն 5 րոպե ինկուբացելով: Օգտագործեք Leica DFC425 թվային տեսախցիկը՝ Leica MZ8 մանրադիտակով պատկերներ անմիջապես ստանալու համար: Վարդագույն գունավորված հատվածները քանակականացվել են Image Pro ծրագրաշարի 10-րդ տարբերակի միջոցով (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)): Սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակը կատարվել է ստորև նկարագրվածի համաձայն:
Գիշերը աճեցված մանրէները նոսրացվել են 1:100 հարաբերակցությամբ Մյուլլեր-Հինթոնի արգանակում: 200 մկլ կուլտուրան ավելացվել է ստերիլ 0.2 մկմ Ուոթմանի ցիկլոպորային թաղանթին (Ուոթման, Մեյդսթոուն, Մեծ Բրիտանիա) և տեղադրվել է Մյուլլեր-Հինթոնի ագարի վրա: Կենսաթաղանթային թիթեղները ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում 72 ժամ՝ հասուն կենսաթաղանթի ձևավորմանը նպաստելու համար:
Կենսաթաղանթի հասունացումից 3 օր անց, 3 սմ2 քառակուսի վիրակապը տեղադրվեց անմիջապես կենսաթաղանթի վրա և ինկուբացվեց 37°C ջերմաստիճանում 24 ժամ: Վիրակապը կենսաթաղանթի մակերեսից հանելուց հետո, յուրաքանչյուր կենսաթաղանթի մակերեսին 20 վայրկյան ավելացվեց 1 մլ PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA): Մակերեսները չորացվեցին, նախքան գունային փոփոխությունները գրանցելը Nikon D2300 թվային տեսախցիկով (Nikon UK Ltd., Kingston, UK):
Պատրաստեք գիշերային կուլտուրաներ Մյուլլեր-Հինտոն ագարի վրա, տեղափոխեք առանձին գաղութները 10 մլ Մյուլլեր-Հինտոն արգանակի մեջ և ինկուբացրեք թափահարիչի վրա 37°C (100 պտ/րոպե) ջերմաստիճանում: Գիշերային ինկուբացիայից հետո կուլտուրան նոսրացվեց 1:100 հարաբերակցությամբ Մյուլլեր-Հինտոն արգանակում և 300 մկլ լցվեց 0.2 մկմ շրջանաձև Ուոթման ցիկլոպորային թաղանթի (Ուոթման Ինթերնեշնլ, Մեյդսթոուն, Մեծ Բրիտանիա) վրա Մյուլլեր-Հինտոն ագարի վրա և ինկուբացվեց 37°C ջերմաստիճանում 72 ժամվա ընթացքում: Հասուն կենսաթաղանթը քսվեց վերքին, ինչպես նկարագրված է ստորև:
Կենդանիների հետ բոլոր աշխատանքները կատարվել են Մանչեստրի համալսարանում՝ Կենդանիների բարեկեցության և էթիկական վերանայման գրասենյակի կողմից հաստատված նախագծի լիցենզիայի (P8721BD27) համաձայն և համաձայն Ներքին գործերի նախարարության կողմից 2012 թվականի վերանայված ASPA-ի շրջանակներում հրապարակված ուղեցույցների: Բոլոր հեղինակները հետևել են ժամանման ուղեցույցներին: Բոլոր in vivo ուսումնասիրությունների համար օգտագործվել են ութ շաբաթական C57BL/6j մկներ (Envigo, Oxon, Մեծ Բրիտանիա): Մկները անզգայացվել են իզոֆլուրանով (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Մեծ Բրիտանիա), և նրանց մեջքային մակերեսները սափրվել և մաքրվել են: Այնուհետև յուրաքանչյուր մկան Stiefel բիոպսիայի դակիչի միջոցով (Schuco International, Hertfordshire, Մեծ Բրիտանիա) միջոցով տրվել է 2 × 6 մմ կտրվածքային վերք: Կենսաթաղանթով վարակված վերքերի համար վնասվածքից անմիջապես հետո վերքի մաշկային շերտին քսել վերը նկարագրված 72-ժամյա գաղութային բիոթաղանթ՝ օգտագործելով ստերիլ պատվաստման օղակ, և հեռացնել թաղանթը: Վիրակապման մեկ քառակուսի սանտիմետրը նախապես խոնավացվում է ստերիլ ջրով՝ վերքի խոնավ միջավայրը պահպանելու համար: Վիրակապերը անմիջապես ամրացվել են յուրաքանչյուր վերքի վրա և ծածկվել 3M Tegaderm թաղանթով (3M, Բրեքնել, Մեծ Բրիտանիա) և եզրերի շուրջ ամրացվել Mastisol հեղուկ սոսինձով (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI)՝ լրացուցիչ կպչունություն ապահովելու համար: Որպես ցավազրկող, մկներին տրվել է 0.1 մգ/կգ կոնցենտրացիայով բուպրենորֆին (Animalcare, Յորք, Մեծ Բրիտանիա): Վնասվածքից երեք օր անց մկներին սպանել են 1-ին ժամանակացույցի մեթոդով և անհրաժեշտության դեպքում հեռացնել, կիսել և պահպանել վերքի տարածքը:
Հեմատոքսիլինով (ThermoFisher Scientific) և էոզինով (ThermoFisher Scientific) ներկումը կատարվել է արտադրողի արձանագրության համաձայն: Վերքի մակերեսը և վերէպիթելացումը քանակականացվել են Image Pro ծրագրաշարի 10-րդ տարբերակի (Media Cybernetics Inc, Ռոքվիլ, Մերիլենդ) միջոցով:
Հյուսվածքային հատվածները մոմազերծվել են քսիլոլով (ThermoFisher Scientific, Լաֆբորո, Մեծ Բրիտանիա), վերահիդրատացվել են 100–50% աստիճանավորված էթանոլով և կարճ ժամանակով ընկղմվել ապաիոնացված ջրի մեջ (ThermoFisher Scientific): Իմունահյուսվածքաքիմիական հետազոտությունները կատարվել են VectaStain Elite ABC PK-6104 հավաքածուի (Vector Laboratories, Բուրլինգեմ, Կալիֆոռնիա) միջոցով՝ համաձայն արտադրողի արձանագրության: NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) նեյտրոֆիլների և Ms CD107b Pure M3/84 մակրոֆագերի (BD Biosciences, Ուոքինգհեմ, Մեծ Բրիտանիա) դեմ առաջնային հակամարմինները նոսրացվել են 1:100 հարաբերակցությամբ բլոկավորող լուծույթում և ավելացվել կտրվածքի մակերեսին, որին հաջորդել են 2 հակամարմիններ՝ Anti-, VectaStain ABC և Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substrate հավաքածուի (Vector Laboratories, Բուրլինգեմ, Կալիֆոռնիա) և հականերկվել հեմատոքսիլինով: Պատկերները ստացվել են Olympus BX43 մանրադիտակի և Olympus DP73 թվային տեսախցիկի միջոցով (Olympus, Սաութենդ-օն-Սի, Մեծ Բրիտանիա):
Մաշկի նմուշները ֆիքսվել են 2.5% գլուտարալդեհիդի և 4% ֆորմալդեհիդի մեջ՝ 0.1 Մ HEPES-ում (pH 7.4) 24 ժամ 4°C ջերմաստիճանում: Նմուշները ջրազրկվել են աստիճանավորված էթանոլի միջոցով և չորացվել CO2-ում՝ Quorum K850 կրիտիկական կետի չորանոցով (Quorum Technologies Ltd, Լաութոն, Մեծ Բրիտանիա) և ծածկվել են ոսկի-պալադիումի համաձուլվածքով՝ օգտագործելով Quorum SC7620 մինի փոշիացնող/փայլող արտանետման համակարգ: Նմուշները պատկերվել են FEI Quanta 250 սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի (ThermoFisher Scientific) միջոցով՝ վերքի կենտրոնական կետը պատկերելու համար:
Toto-1 յոդիդը (2 μM) կիրառվել է մկան կտրված վերքի մակերեսին և ինկուբացվել է 5 րոպե 37°C ջերմաստիճանում (ThermoFisher Scientific) և մշակվել Syto-60-ով (10 μM) 37°C ջերմաստիճանում (ThermoFisher Scientific): 15 րոպեանոց Z-stack պատկերները ստեղծվել են Leica TCS SP8-ի միջոցով:
Կենսաբանական և տեխնիկական կրկնօրինակ տվյալները աղյուսակավորվել և վերլուծվել են Graphpad Prism V9 ծրագրաշարի միջոցով (GraphPad Software, La Jolla, CA): Յուրաքանչյուր բուժման և ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերի միջև տարբերությունները ստուգելու համար օգտագործվել է միակողմանի դիսպերսիայի վերլուծություն՝ բազմակի համեմատություններով, որոնք օգտագործում են Դաննեթի հետհոկ թեստը: p արժեքը <0.05 համարվել է նշանակալի:
Արծաթե գելային մանրաթելային վիրակապերի արդյունավետությունը նախ գնահատվել է Staphylococcus aureus-ի և Pseudomonas aeruginosa-ի բիոթաղանթային գաղութների նկատմամբ in vitro: Արծաթե վիրակապերը պարունակում են արծաթի տարբեր բանաձևեր. ավանդական արծաթե վիրակապերը արտադրում են Ag1+ իոններ. արծաթե վիրակապերը, որոնք կարող են արտադրել Ag1+ իոններ EDTA/BC-ի ավելացումից հետո, կարող են ոչնչացնել բիոթաղանթի մատրիցը և արծաթե իոնների15 հակաբակտերիալ ազդեցության տակ ենթարկել մանրէներին արծաթի և թթվածնավորված Ag աղեր պարունակող վիրակապերի, որոնք արտադրում են Ag1+, Ag2+ և Ag3+ իոններ: Դրա արդյունավետությունը համեմատվել է գելային մանրաթելերից պատրաստված ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերի հետ: Կենսաթաղանթի ներսում մնացած կենսունակ մանրէները գնահատվել են յուրաքանչյուր 24 ժամը մեկ 8 օրվա ընթացքում (Նկար 1): 5-րդ օրը բիոթաղանթը կրկին ներարկվել է 3.85 × 105S. Staphylococcus aureus կամ 1.22×105P. aeruginosa՝ բիոթաղանթի վերականգնումը գնահատելու համար: Համեմատած ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերի հետ, Ag1+ վիրակապերը նվազագույն ազդեցություն ունեցան Staphylococcus aureus և Pseudomonas aeruginosa բիոթաղանթների բակտերիալ կենսունակության վրա 5 օրվա ընթացքում: Ի տարբերություն դրա, թթվածնավորված Ag և Ag1+ + EDTA/BC աղեր պարունակող վիրակապերը արդյունավետ էին բիոթաղանթի ներսում գտնվող բակտերիաները ոչնչացնելու համար 5 օրվա ընթացքում: 5-րդ օրը պլանկտոնային բակտերիաներով կրկնակի պատվաստումից հետո բիոթաղանթի վերականգնում չի դիտվել (Նկար 1):
Արծաթե վիրակապերով մշակումից հետո Staphylococcus aureus և Pseudomonas aeruginosa բիոթաղանթներում կենսունակ բակտերիաների քանակական որոշում: Staphylococcus aureus և Pseudomonas aeruginosa-ի բիոթաղանթային գաղութները մշակվել են արծաթե վիրակապերով կամ ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերով, և մնացած կենսունակ բակտերիաների քանակը որոշվել է յուրաքանչյուր 24 ժամը մեկ: 5 օր անց բիոթաղանթը վերստին ներծծվել է 3.85×105S. Staphylococcus aureus կամ 1.22×105P լուծույթներով: Pseudomonas aeruginosa բակտերիոպլանկտոնի գաղութները ձևավորվել են անհատապես՝ բիոթաղանթի վերականգնումը գնահատելու համար: Գրաֆիկները ցույց են տալիս միջին +/- ստանդարտ սխալ:
Արծաթե վիրակապերի ազդեցությունը կենսաթաղանթի կենսունակության վրա պատկերացնելու համար վիրակապերը կիրառվել են ex vivo խոզի մաշկի վրա աճեցված հասուն կենսաթաղանթների վրա: 24 ժամ անց վիրակապը հեռացվում է, և կենսաթաղանթը ներկվում է կապույտ ռեակտիվ ներկանյութով, որը կենդանի մանրէների կողմից նյութափոխանակվում է մինչև վարդագույն գույն: Վերահսկիչ վիրակապերով մշակված կենսաթաղանթները վարդագույն էին, ինչը ցույց է տալիս կենսաթաղանթի ներսում կենսունակ մանրէների առկայությունը (Նկար 2Ա): Ի տարբերություն դրա, Ag օքսիզոլների վիրակապով մշակված կենսաթաղանթը հիմնականում կապույտ էր, ինչը ցույց է տալիս, որ խոզի մաշկի մակերեսին մնացած մանրէները ոչ կենսունակ մանրէներ էին (Նկար 2Բ): Ag1+ պարունակող վիրակապերով մշակված կենսաթաղանթներում դիտվել է խառը կապույտ և վարդագույն գունավորում, ինչը ցույց է տալիս կենսաթաղանթի ներսում կենսունակ և ոչ կենսունակ մանրէների առկայությունը (Նկար 2Գ), մինչդեռ Ag1+ պարունակող EDTA/BC վիրակապերը հիմնականում կապույտ էին՝ որոշ վարդագույն բծերով, ինչը ցույց է տալիս արծաթե վիրակապից չտուժած տարածքները (Նկար 2Դ): Ակտիվ (վարդագույն) և ոչ ակտիվ (կապույտ) տարածքների քանակական որոշումը ցույց է տվել, որ վերահսկիչ հատվածը 75% ակտիվ է եղել (Նկար 2Ե): Ag1+ + EDTA/BC վիրակապերի կիրառումը նման էր թթվածնացված Ag աղով վիրակապերի կիրառմանը՝ համապատասխանաբար 13% և 14% գոյատևման մակարդակներով: Ag1+ վիրակապը նաև 21%-ով նվազեցրել է մանրէների կենսունակությունը: Այս կենսաթաղանթները այնուհետև դիտարկվել են սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի (SEM) միջոցով: Վերահսկիչ վիրակապով և Ag1+ վիրակապով մշակումից հետո խոզի մաշկը ծածկող Pseudomonas aeruginosa-ի շերտ է նկատվել (Նկար 2F,H), մինչդեռ Ag1+ վիրակապով մշակումից հետո քիչ բակտերիալ բջիջներ են հայտնաբերվել և դրանց տակ քիչ բակտերիալ բջիջներ: Կոլագենային մանրաթելերը կարելի է դիտարկել որպես խոզի մաշկի հյուսվածքային կառուցվածք (Նկար 2G): Ag1+ + EDTA/BC վիրակապով մշակումից հետո տեսանելի են եղել բակտերիալ վահանիկներ և դրա տակ գտնվող կոլագենային մանրաթելային վահանիկներ (Նկար 2I):
Pseudomonas aeruginosa բիոթաղանթի վիզուալիզացիա արծաթե վիրակապով մշակումից հետո: (A–D) Խոզի մաշկի վրա աճեցված Pseudomonas aeruginosa բիոթաղանթներում մանրէային կենսունակությունը վիզուալիզացվել է PrestoBlue կենսունակության ներկանյութի միջոցով՝ արծաթե վիրակապերով կամ ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերով մշակումից 24 ժամ անց: Կենդանի մանրէները վարդագույն են, ոչ կենսունակ մանրէները և խոզի մաշկը կապույտ են: (E) Խոզի մաշկի վրա աճեցված Pseudomonas aeruginosa բիոթաղանթների քանակական որոշումը՝ սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի Image Pro տարբերակ 10 (FI) միջոցով և մշակված արծաթե վիրակապով կամ ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապով 24 ժամ: SEM սանդղակի գիծ = 5 մկմ: (J–M) Գաղութային բիոթաղանթները աճել են ֆիլտրերի վրա և ներկվել են PrestoBlue ռեակտիվ ներկանյութով՝ արծաթե վիրակապերով 24 ժամ ինկուբացիայից հետո:
Վիրակապերի և բիոթաղանթների միջև սերտ շփումը վիրակապերի արդյունավետության վրա ազդելու հարցը որոշելու համար, հարթ մակերեսի վրա տեղադրված գաղութային բիոթաղանթները մշակվել են վիրակապերով 24 ժամ, ապա ներկվել ռեակտիվ ներկանյութերով: Չմշակված բիոթաղանթը մուգ վարդագույն գույնի էր (Նկար 2J): Ի տարբերություն թթվածնացված Ag աղեր պարունակող վիրակապերով մշակված բիոթաղանթների (Նկար 2K), Ag1+ կամ Ag1+ + EDTA/BC պարունակող վիրակապերով մշակված բիոթաղանթները ցույց են տվել վարդագույն ներկման շերտեր (Նկար 2L,M): Այս վարդագույն գունավորումը ցույց է տալիս կենսունակ մանրէների առկայությունը և կապված է վիրակապերի ներսում կարերի տարածքի հետ: Այս կարված տարածքները ստեղծում են մեռյալ տարածքներ, որոնք թույլ են տալիս բիոթաղանթի ներսում գտնվող մանրէներին գոյատևել:
Արծաթե վիրակապերի արդյունավետությունը in vivo գնահատելու համար, հասուն S. aureus և P. aeruginosa բիոթաղանթներով վարակված մկների լրիվ հաստությամբ կտրված վերքերը մշակվել են ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերով կամ արծաթե վիրակապերով: Բուժումից 3 օր անց մակրոսկոպիկ պատկերի վերլուծությունը ցույց է տվել վերքերի ավելի փոքր չափսեր, երբ դրանք մշակվել են թթվածնով հարստացված աղային վիրակապերով՝ համեմատած ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերի և այլ արծաթե վիրակապերի հետ (Նկար 3A-H): Այս դիտարկումները հաստատելու համար վերքերը հավաքվել են, և վերքի մակերեսը և վերաէպիթելիզացիան քանակականացվել են հեմատոքսիլինով և էոզինով ներկված հյուսվածքների հատվածների վրա՝ օգտագործելով image pro ծրագրաշարի 10-րդ տարբերակը (Նկար 3I-L):
Արծաթե վիրակապերի ազդեցությունը վերքի մակերեսի վրա և բիոթաղանթներով վարակված վերքերի վերաէպիթելիզացիան: (A–H) Pseudomonas aeruginosa (A–D) և Staphylococcus aureus (E–H) բիոթաղանթներով վարակված փոքր բջիջներ՝ ոչ հակամանրէային վերահսկող վիրակապով, թթվածնացված Ag աղով վիրակապով, Ag1+ վիրակապով և Ag1+ վիրակապով երեքօրյա բուժումից հետո: Ներկայացուցչական մակրոսկոպիկ պատկերներ: Ag1+ + EDTA/BC վիրակապով մկների վերքեր: (IL) Ներկայացուցչական Pseudomonas aeruginosa վարակ, հյուսվածաբանական հատույթներ, որոնք ներկված են հեմատոքսիլինով և էոզինով, օգտագործվել են վերքի մակերեսը և էպիթելի վերականգնումը քանակականացնելու համար: Pseudomonas aeruginosa (M, N) և Staphylococcus aureus (O, P) բիոթաղանթներով վարակված վերքերի վերքի մակերեսի (M, O) և վերաէպիթելիզացիայի տոկոսի (N, P) քանակականացում (յուրաքանչյուր բուժման խմբի համար n = 12): Գրաֆիկները ցույց են տալիս միջին +/- ստանդարտ սխալը: * նշանակում է p = < 0.05 ** նշանակում է p = < 0.01; մակրոսկոպիկ մասշտաբ = 2.5 մմ, հյուսվածաբանական մասշտաբ = 500 մկմ:
Pseudomonas aeruginosa բիոթաղանթով վարակված վերքերի վերքի մակերեսի քանակական որոշումը (Նկար 3M) ցույց տվեց, որ Ag օքսիաղերով մշակված վերքերի միջին չափը 2.5 մմ2 էր, մինչդեռ ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապով մշակված վերքերի միջին չափը 3.1 մմ2 էր, ինչը ճիշտ չէ։ հասել է վիճակագրորեն նշանակալիության (Նկար 3M): p = 0.423): Ag1+ կամ Ag1+ + EDTA/BC-ով մշակված վերքերը վերքի մակերեսի նվազում չեն ցուցաբերել (համապատասխանաբար՝ 3.1 մմ2 և 3.6 մմ2): Թթվածնավորված Ag աղով վիրակապով բուժումը ավելի մեծ չափով նպաստել է վերէպիթելիզացիային, քան ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապով բուժումը (համապատասխանաբար՝ 34% և 15%; p = 0.029) և Ag1+ կամ Ag1+ + EDTA/BC-ով (համապատասխանաբար՝ 10% և 11%) (Նկար 3N):
Վերքի մակերեսի և էպիթելի վերականգնման նմանատիպ միտումներ են նկատվել S. aureus բիոթաղանթներով վարակված վերքերում (Նկար 3O): Թթվածնավորված արծաթե աղեր պարունակող վիրակապերը վերքի մակերեսը (2.0 մմ2) կրճատել են 23%-ով՝ համեմատած վերահսկիչ ոչ հակամանրէային վիրակապերի (2.6 մմ2) հետ, չնայած այս նվազումը նշանակալի չէր (p = 0.304) (Նկար 3O): Բացի այդ, Ag1+ բուժական խմբում վերքի մակերեսը փոքր-ինչ նվազել էր (2.4 մմ2), մինչդեռ Ag1+ + EDTA/BC վիրակապով մշակված վերքը չի կրճատել վերքի մակերեսը (2.9 մմ2): Ag-ի թթվածնային աղերը նույնպես ավելի մեծ չափով նպաստել են S. aureus բիոթաղանթով վարակված վերքերի վերաէպիթելիզացմանը (31%), քան ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերով մշակվածները (12%, p = 0.003) (Նկար 3P): Ag1+ վիրակապը (16%, p = 0.903) և Ag+1 + EDTA/BC վիրակապը (14%, p = 0.965) ցույց տվեցին էպիթելի վերականգնման մակարդակներ, որոնք նման էին վերահսկիչ խմբին։
Արծաթե վիրակապերի ազդեցությունը բիոթաղանթի մատրիցի վրա պատկերացնելու համար կատարվել է Toto 1 և Syto 60 յոդի ներկում (Նկար 4): Toto 1 յոդիդը բջիջների համար անթափանց ներկ է, որը կարող է օգտագործվել բիոթաղանթների EPS-ում առատորեն առկա արտաբջջային նուկլեինաթթուները ճշգրիտ պատկերացնելու համար: Syto 60-ը բջիջների համար թափանցելի ներկ է, որն օգտագործվում է որպես հականերկանյութ16: Pseudomonas aeruginosa-ի (Նկար 4A-D) և Staphylococcus aureus-ի (Նկար 4I-L) բիոթաղանթներով (Նկար 4I-L) պատվաստված վերքերում Toto 1 և Syto 60 յոդի դիտարկումները ցույց են տվել, որ վիրակապով 3 օր բուժումից հետո բիոթաղանթում EPS-ի քանակը զգալիորեն նվազել է, որը պարունակում է Ag և Ag1+ + EDTA/BC թթվածնավորված աղեր: Ag1+ վիրակապերը, որոնք լրացուցիչ հակաբիոթաղանթային բաղադրիչներ չունեն, զգալիորեն նվազեցրել են բջջային ազատ ԴՆԹ-ն Pseudomonas aeruginosa-ով պատվաստված վերքերում, բայց պակաս արդյունավետ են եղել Staphylococcus aureus-ով պատվաստված վերքերում:
Վերքի բիոթաղանթի in vivo պատկերացում՝ վերահսկիչ կամ արծաթե վիրակապերով 3 օր բուժումից հետո: Pseudomonas aeruginosa (A–D) և Staphylococcus aureus (I–L) կոնֆոկալ պատկերներ՝ ներկված Toto 1-ով (կանաչ)՝ արտաբջջային նուկլեինաթթուները, որոնք արտաբջջային բիոթաղանթի պոլիմերների բաղադրիչ են, տեսանելի դարձնելու համար: Բջջային նուկլեինաթթուները ներկելու համար օգտագործեք Syto 60 (կարմիր): թթուներ: P. Pseudomonas aeruginosa (E–H) և Staphylococcus aureus (M–P) բիոթաղանթներով վարակված վերքերի սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակ՝ վերահսկիչ և արծաթե վիրակապերով 3 օր բուժումից հետո: SEM սանդղակի գիծ = 5 մկմ: Կոնֆոկալ պատկերման սանդղակի գիծ = 50 մկմ:
Սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակը ցույց տվեց, որ Pseudomonas aeruginosa-ի (Նկար 4E-H) և Staphylococcus aureus-ի (Նկար 4M-P) կենսաթաղանթային գաղութներով պատվաստված մկների վերքերում 3 օր արծաթե վիրակապերով բուժումից հետո զգալիորեն ավելի քիչ մանրէներ կային։
Արծաթե վիրակապերի ազդեցությունը կենսաթաղանթով վարակված մկների վերքերի բորբոքման վրա գնահատելու համար, վերահսկիչ կամ արծաթե վիրակապերով 3 օր մշակված կենսաթաղանթով վարակված վերքերի հատվածները իմունահյուսվածքաքիմիականորեն ներկվել են՝ օգտագործելով նեյտրոֆիլների և մակրոֆագերի համար հատուկ հակամարմիններ: Նեյտրոֆիլների և մակրոֆագերի ներքին քանակական որոշում: գրանուլյացիոն հյուսվածք: Նկար 5): Բոլոր արծաթե վիրակապերը նվազեցրել են նեյտրոֆիլների և մակրոֆագերի քանակը Pseudomonas aeruginosa-ով վարակված վերքերում՝ համեմատած ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապերի հետ՝ երեք օրվա բուժումից հետո: Այնուամենայնիվ, թթվածնացված արծաթե աղով վիրակապով բուժումը հանգեցրել է նեյտրոֆիլների (p = <0.0001) և մակրոֆագերի (p = <0.0001) ավելի մեծ նվազման՝ համեմատած այլ փորձարկված արծաթե վիրակապերի հետ (Նկար 5I,J): Չնայած Ag1+ + EDTA/BC-ն ավելի մեծ ազդեցություն է ունեցել վերքի կենսաթաղանթի վրա, այն նվազեցրել է նեյտրոֆիլների և մակրոֆագերի մակարդակը ավելի փոքր չափով, քան Ag1+ վիրակապը: S. aureus բիոթաղանթով վարակված միջին աստիճանի վերքեր դիտվել են նաև Ag (p = <0.0001), Ag1+ (p = 0.0008) և Ag1++ EDTA/BC (p = 0.0043) օքսիզոլներով վիրակապելուց հետո՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ: Նմանատիպ միտումներ են դիտվում նաև նեյտրոպենիայի դեպքում: վիրակապ (Նկ. 5K): Այնուամենայնիվ, միայն թթվածնավորված Ag աղով վիրակապը ցույց տվեց գրանուլյացիոն հյուսվածքում մակրոֆագերի քանակի զգալի նվազում՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ՝ S. aureus բիոթաղանթներով վարակված վերքերում (p = 0.0339) (Նկար 5L):
Pseudomonas aeruginosa և Staphylococcus aureus բիոթաղանթներով վարակված վերքերում նեյտրոֆիլներն ու մակրոֆագերը քանակապես որոշվել են ոչ հակամանրէային վերահսկիչ կամ արծաթե վիրակապերով 3 օր բուժումից հետո: Նեյտրոֆիլները (AD) և մակրոֆագերը (EH) քանակապես որոշվել են հյուսվածքային հատվածներում, որոնք ներկված են նեյտրոֆիլների կամ մակրոֆագերի համար հատուկ հակամարմիններով: Pseudomonas aeruginosa (I և J) և Staphylococcus aureus (K & L) բիոթաղանթներով վարակված վերքերում նեյտրոֆիլների (I և K) և մակրոֆագերի (J և L) քանակապես որոշում: N = 12 մեկ խմբի համար: Գրաֆիկները ցույց են տալիս միջին +/- ստանդարտ սխալը, նշանակալիության արժեքները՝ համեմատած ոչ հակաբակտերիալ վերահսկիչ վիրակապերի հետ, * նշանակում է p = < 0.05, ** նշանակում է p = < 0.01; *** նշանակում է p = < 0.001; ցույց է տալիս p = <0.0001):
Այնուհետև մենք գնահատեցինք արծաթե վիրակապերի ազդեցությունը վարակից անկախ բուժման վրա: Ոչ վարակված հեռացնող վերքերը մշակվել են ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապով կամ արծաթե վիրակապով 3 օրվա ընթացքում (Նկար 6): Փորձարկված արծաթե վիրակապերից միայն թթվածնով հարստացված աղային վիրակապով մշակված վերքերն էին մակրոսկոպիկ պատկերների վրա ավելի փոքր թվում, քան վերահսկիչ խմբով մշակված վերքերը (Նկար 6A-D): Վերքի մակերեսի քանակական որոշումը հյուսվածաբանական վերլուծության միջոցով ցույց տվեց, որ Ag oxysols վիրակապով մշակումից հետո վերքի միջին մակերեսը կազմել է 2.35 մմ2՝ համեմատած վերահսկիչ խմբով մշակված վերքերի 2.96 մմ2-ի հետ, սակայն այս տարբերությունը վիճակագրորեն նշանակալի չի եղել (p = 0.488) (Նկար 6I): Ի տարբերություն դրա, Ag1+ (3.38 մմ2, p = 0.757) կամ Ag1+ + EDTA/BC (4.18 մմ2, p = 0.054) վիրակապերով մշակումից հետո վերքի մակերեսի նվազում չի նկատվել՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ: Ag օքսիզոլային վիրակապով էպիթելի վերականգնման աճ է նկատվել վերահսկիչ խմբի համեմատ (համապատասխանաբար 30% ընդդեմ 22%), չնայած սա նշանակալիության չի հասել (p = 0.067), սա բավականին նշանակալի է և հաստատում է նախորդ արդյունքները: Օքսիզոլներով վիրակապը նպաստում է վերէպիթելիզացիային: -Չվարակված վերքերի էպիթելիզացիա17: Ի տարբերություն դրա, Ag1+ կամ Ag1+ + EDTA/BC վիրակապերով բուժումը ազդեցություն չի ունեցել կամ ցույց է տվել վերէպիթելիզացիայի նվազում վերահսկիչ խմբի համեմատ:
Արծաթե վերքի վիրակապման ազդեցությունը չվարակված մկների վերքերի լավացման վրա՝ լրիվ հեռացմամբ: (AD) Վերքերի ներկայացուցչական մակրոսկոպիկ պատկերներ՝ ոչ հակամանրէային վերահսկիչ վիրակապով և արծաթե վիրակապով երեքօրյա բուժումից հետո: (EH) Հեմատոքսիլինով և էոզինով ներկված ներկայացուցչական վերքի հատվածներ: Վերքի մակերեսի (I) և վերէպիթելիզացիայի տոկոսի (J) քանակական որոշումը հաշվարկվել է վերքի միջնակետում գտնվող հյուսվածաբանական հատվածներից՝ օգտագործելով պատկերի վերլուծության ծրագիր (n = 11–12 յուրաքանչյուր բուժման խմբի համար): Գրաֆիկները ցույց են տալիս միջին +/- ստանդարտ սխալը: * նշանակում է p = <0.05:
Արծաթը երկար պատմություն ունի որպես վերքերի բուժման հակամանրէային թերապիա, սակայն բազմաթիվ տարբեր բանաձևերը և ներարկման մեթոդները կարող են հանգեցնել հակամանրէային արդյունավետության տարբերությունների18: Ավելին, արծաթի ներարկման որոշակի համակարգերի հակաբիոթաղանթային հատկությունները լիովին հասկանալի չեն: Չնայած տիրոջ իմունային պատասխանը համեմատաբար արդյունավետ է պլանկտոնային մանրէների դեմ, այն ընդհանուր առմամբ պակաս արդյունավետ է բիոթաղանթների դեմ19: Պլանկտոնային մանրէները հեշտությամբ ֆագոցիտոզվում են մակրոֆագերի կողմից, սակայն բիոթաղանթների ներսում ագրեգացված բջիջները լրացուցիչ խնդիրներ են առաջացնում՝ սահմանափակելով տիրոջ պատասխանը այնքանով, որ իմունային բջիջները կարող են ապոպտոզ ենթարկվել և արտազատել պրոբորբոքային գործոններ՝ իմունային պատասխանը ուժեղացնելու համար20: Նկատվել է, որ որոշ լեյկոցիտներ կարող են թափանցել բիոթաղանթների մեջ21, բայց չեն կարողանում ֆագոցիտոզ անել մանրէների մեջ, երբ այս պաշտպանությունը խաթարվում է22: Վերքի բիոթաղանթի վարակի դեմ տիրոջ իմունային պատասխանը աջակցելու համար պետք է կիրառվի ամբողջական մոտեցում: Վերքի մաքրումը կարող է ֆիզիկապես խաթարել բիոթաղանթը և հեռացնել բիոբեռի մեծ մասը, սակայն տիրոջ իմունային պատասխանը կարող է անարդյունավետ լինել մնացած բիոթաղանթի դեմ, հատկապես, եթե տիրոջ իմունային պատասխանը խաթարված է: Այսպիսով, հակամանրէային թերապիաները, ինչպիսիք են արծաթե վիրակապերը, կարող են աջակցել տիրոջ իմունային պատասխանին և վերացնել բիոթաղանթի վարակները: Արծաթի կազմը, կոնցենտրացիան, լուծելիությունը և առաքման սուբստրատը կարող են ազդել արծաթի հակամանրէային արդյունավետության վրա: Վերջին տարիներին արծաթի մշակման տեխնոլոգիայի առաջընթացը այս վիրակապերը դարձրել է ավելի արդյունավետ9,23: Արծաթե վիրակապերի տեխնոլոգիայի զարգացմանը զուգընթաց կարևոր է հասկանալ այս վիրակապերի արդյունավետությունը վերքի վարակի վերահսկման գործում և, ավելի կարևորը, արծաթի այս հզոր ձևերի ազդեցությունը վերքի միջավայրի և բուժման վրա:
Այս ուսումնասիրության մեջ մենք համեմատեցինք երկու առաջադեմ արծաթե վիրակապերի արդյունավետությունը ավանդական արծաթե վիրակապերի հետ, որոնք արտադրում են Ag1+ իոններ բիոթաղանթների դեմ՝ օգտագործելով տարբեր in vitro և in vivo մոդելներ: Մենք նաև գնահատեցինք այս վիրակապերի ազդեցությունը վերքի միջավայրի և վարակից անկախ ապաքինման վրա: Արմատուրայի ազդեցությունը նվազագույնի հասցնելու համար փորձարկված բոլոր արծաթե վիրակապերը կազմված էին կարբօքսիմեթիլցելյուլոզից:
Այս արծաթե վիրակապերի մեր նախնական գնահատումը Pseudomonas aeruginosa-ի և Staphylococcus aureus-ի գաղութային բիոթաղանթների դեմ ցույց է տալիս, որ ավանդական Ag1+ վիրակապերից ի տարբերություն, երկու առաջադեմ արծաթե վիրակապերը՝ Ag1+ + EDTA/BC-ն և թթվածնացված Ag աղերը, արդյունավետ են 5-ի դեպքում։ Արդյունավետորեն ոչնչացնում են բիոթաղանթի մանրէները մի քանի օրվա ընթացքում։ Բացի այդ, այս վիրակապերը կանխում են բիոթաղանթի վերագոյացումը պլանկտոնային մանրէների կրկնակի ազդեցության դեպքում։ Ag1+ վիրակապը պարունակում էր արծաթի քլորիդ, նույն արծաթե միացությունը և հիմքային մատրիցը, ինչ Ag1+ + EDTA/BC-ն, և նույն ժամանակահատվածում սահմանափակ ազդեցություն ուներ բիոթաղանթի ներսում մանրէների կենսունակության վրա։ Այն դիտարկումը, որ Ag1+ + EDTA/BC վիրակապն ավելի արդյունավետ էր բիոթաղանթի դեմ, քան նույն մատրիցից և արծաթե միացությունից բաղկացած Ag1+ վիրակապը, հաստատում է այն միտքը, որ արծաթի քլորիդի բիոթաղանթի դեմ արդյունավետությունը բարձրացնելու համար անհրաժեշտ են լրացուցիչ բաղադրիչներ, ինչպես արդեն նշվել է այլուր15։ Այս արդյունքները հաստատում են այն գաղափարը, որ BC-ն և EDTA-ն լրացուցիչ դեր են խաղում վիրակապերի ընդհանուր արդյունավետության մեջ, և որ այս բաղադրիչի բացակայությունը Ag1+ վիրակապերում կարող է նպաստել in vitro արդյունավետության չցուցադրմանը: Մենք պարզեցինք, որ Ag2+ և Ag3+ իոններ արտադրող թթվածնավորված Ag աղի վիրակապերը ցուցաբերել են ավելի ուժեղ հակաբակտերիալ արդյունավետություն, քան Ag1+-ը, և Ag1+ + EDTA/BC-ի նման մակարդակներում: Այնուամենայնիվ, բարձր օքսիդա-վերականգնման պոտենցիալի պատճառով պարզ չէ, թե որքան ժամանակ Ag3+ իոնները մնում են ակտիվ և արդյունավետ վերքի բիոթաղանթների դեմ և, հետևաբար, արժանի են հետագա ուսումնասիրության: Բացի այդ, կան բազմաթիվ տարբեր վիրակապեր, որոնք առաջացնում են Ag1+ իոններ, որոնք չեն փորձարկվել այս ուսումնասիրության մեջ: Այս վիրակապերը կազմված են տարբեր արծաթե միացություններից, կոնցենտրացիաներից և բազային մատրիցներից, որոնք կարող են ազդել Ag1+ իոնների մատակարարման և դրանց բիոթաղանթների դեմ արդյունավետության վրա: Նաև հարկ է նշել, որ կան բազմաթիվ տարբեր in vitro և in vivo մոդելներ, որոնք օգտագործվում են բիոթաղանթների դեմ վերքի վիրակապերի արդյունավետությունը գնահատելու համար: Օգտագործված մոդելի տեսակը, ինչպես նաև այս մոդելներում օգտագործվող միջավայրերի աղի և սպիտակուցի պարունակությունը, կազդեն վիրակապերի արդյունավետության վրա: Մեր in vivo մոդելում մենք թույլ տվեցինք, որ բիոթաղանթը հասունանա in vitro, ապա այն տեղափոխեցինք վերքի մաշկի մակերեսին: Հյուրընկալող մկան իմունային պատասխանը համեմատաբար արդյունավետ է վերքին քսվող պլանկտոնային բակտերիաների դեմ, այդպիսով վերքի լավացմանը զուգընթաց ձևավորելով բիոթաղանթ: Վերքին հասուն բիոթաղանթի ավելացումը սահմանափակում է տիրոջ իմունային պատասխանի արդյունավետությունը բիոթաղանթի ձևավորման նկատմամբ՝ թույլ տալով, որ հասուն բիոթաղանթը հաստատվի վերքի ներսում՝ նախքան լավացման սկիզբը: Այսպիսով, մեր մոդելը թույլ է տալիս մեզ գնահատել հակամանրէային վիրակապերի արդյունավետությունը հասուն բիոթաղանթների վրա՝ նախքան վերքերի լավացման սկիզբը:
Մենք նաև պարզեցինք, որ վիրակապի համապատասխանությունը ազդում է արծաթե վիրակապերի արդյունավետության վրա in vitro աճեցված բիոթաղանթների և խոզի մաշկի վրա: Վերքի հետ սերտ շփումը համարվում է կարևոր վիրակապի հակամանրէային արդյունավետության համար24,25: Թթվածնավորված Ag աղեր պարունակող վիրակապերը սերտ շփման մեջ էին հասուն բիոթաղանթների հետ, ինչը հանգեցրեց բիոթաղանթի ներսում կենսունակ մանրէների քանակի զգալի նվազմանը 24 ժամ անց: Ի տարբերություն դրա, Ag1+ և Ag1+ + EDTA/BC վիրակապերով մշակման ժամանակ, զգալի թվով կենսունակ մանրէներ մնացին: Այս վիրակապերը պարունակում են կարեր վիրակապի ամբողջ երկարությամբ, ինչը ստեղծում է մեռյալ տարածքներ, որոնք կանխում են բիոթաղանթի հետ սերտ շփումը: Մեր in vitro ուսումնասիրություններում այս ոչ շփման տարածքները կանխել են կենսունակ մանրէների ոչնչացումը բիոթաղանթի ներսում: Մենք գնահատել ենք մանրէների կենսունակությունը միայն 24 ժամ մշակումից հետո. ժամանակի ընթացքում, երբ վիրակապն ավելի հագեցած է դառնում, կարող է ավելի քիչ մեռյալ տարածք լինել, ինչը նվազեցնում է այդ կենսունակ մանրէների համար նախատեսված տարածքը: Այնուամենայնիվ, սա ընդգծում է վիրակապի կազմի կարևորությունը, այլ ոչ թե միայն վիրակապում արծաթի տեսակի:
Թեև in vitro ուսումնասիրությունները օգտակար են տարբեր արծաթե տեխնոլոգիաների արդյունավետությունը համեմատելու համար, կարևոր է նաև հասկանալ այս վիրակապերի ազդեցությունը բիոթաղանթների վրա in vivo, որտեղ տիրոջ հյուսվածքը և իմունային պատասխանները նպաստում են վիրակապերի արդյունավետությանը բիոթաղանթների դեմ: Այս վիրակապերի ազդեցությունը վերքի բիոթաղանթների վրա դիտարկվել է սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի և բիոթաղանթի EPS ներկման միջոցով՝ օգտագործելով ներբջջային և արտաբջջային ԴՆԹ ներկանյութեր: Մենք պարզեցինք, որ 3 օրվա բուժումից հետո բոլոր վիրակապերը արդյունավետ էին բիոթաղանթով վարակված վերքերում բջջային ազատ ԴՆԹ-ի նվազեցման գործում, բայց Ag1+ վիրակապը պակաս արդյունավետ էր Staphylococcus aureus-ով վարակված վերքերի դեպքում: Սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակը նաև ցույց տվեց, որ արծաթե վիրակապերով մշակված վերքերում առկա էին զգալիորեն ավելի քիչ մանրէներ, չնայած դա ավելի ցայտուն էր թթվածնացված Ag աղով վիրակապով և Ag1+ + EDTA/BC վիրակապով, քան Ag1+ վիրակապով: Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ փորձարկված արծաթե վիրակապերը տարբեր աստիճանի ազդեցություն են ունեցել բիոթաղանթի կառուցվածքի վրա, բայց արծաթե վիրակապերից ոչ մեկը չի կարողացել վերացնել բիոթաղանթը, ինչը հաստատում է վերքի բիոթաղանթի վարակների բուժման համալիր մոտեցման անհրաժեշտությունը. արծաթե թևկապերի օգտագործում: Բուժմանը նախորդում է ֆիզիկական մաքրում՝ բիոթաղանթի մեծ մասը հեռացնելու համար:
Քրոնիկ վերքերը հաճախ գտնվում են ծանր բորբոքման վիճակում, որի դեպքում վերքի հյուսվածքում երկար ժամանակ մնում են բորբոքային բջիջների ավելցուկը, ինչը հանգեցնում է հյուսվածքների վնասման և վերքի բջջային արդյունավետ նյութափոխանակության և գործառույթի համար անհրաժեշտ թթվածնի սպառման26: Կենսաթաղանթները սրում են վերքի այս թշնամական միջավայրը՝ բացասաբար ազդելով ապաքինման վրա տարբեր ձևերով, ներառյալ բջիջների բազմացման և միգրացիայի արգելակումը և բորբոքային ցիտոկինների ակտիվացումը27: Քանի որ արծաթե վիրակապերը դառնում են ավելի արդյունավետ, կարևոր է հասկանալ դրանց ազդեցությունը վերքի միջավայրի և ապաքինման վրա:
Հետաքրքիր է, որ չնայած բոլոր արծաթե վիրակապերը ազդում էին կենսաթաղանթի կազմի վրա, միայն թթվածնով հարստացված արծաթե աղով վիրակապերն էին մեծացնում այս վարակված վերքերի վերաէպիթելացումը: Այս տվյալները հաստատում են մեր նախորդ արդյունքները17 և Կալանի և այլոց (2017)28 արդյունքները, որոնք ցույց են տվել թթվածնով հարստացված արծաթե աղերի լավ անվտանգության և թունավորության պրոֆիլները, քանի որ արծաթի ավելի ցածր կոնցենտրացիաները արդյունավետ էին կենսաթաղանթների դեմ:
Մեր ներկայիս ուսումնասիրությունը ընդգծում է արծաթի տեխնոլոգիայի տարբերությունները հակամանրէային արծաթե վիրակապերի միջև և այս տեխնոլոգիայի ազդեցությունը վերքի միջավայրի և վարակից անկախ բուժման վրա: Այնուամենայնիվ, այս արդյունքները տարբերվում են նախորդ ուսումնասիրություններից, որոնք ցույց են տվել, որ Ag1+ + EDTA/BC վիրակապը բարելավել է վնասված նապաստակի ականջների բուժման պարամետրերը in vivo: Այնուամենայնիվ, սա կարող է պայմանավորված լինել կենդանիների մոդելների, չափման ժամանակների և մանրէային կիրառման մեթոդների տարբերություններով29: Այս դեպքում վերքի չափումները կատարվել են վնասվածքից 12 օր անց, որպեսզի վիրակապի ակտիվ բաղադրիչները կարողանան ազդել կենսաթաղանթի վրա ավելի երկար ժամանակահատվածում: Սա հաստատվում է մի ուսումնասիրությամբ, որը ցույց է տվել, որ Ag1+ + EDTA/BC-ով բուժված կլինիկորեն վարակված ոտքի խոցերը սկզբում մեծացել են չափսերով բուժումից մեկ շաբաթ անց, ապա Ag1+ + EDTA/BC-ով բուժման հաջորդ 3 շաբաթվա ընթացքում և ոչ հակամանրէային դեղամիջոցների օգտագործումից 4 շաբաթվա ընթացքում: CMC վիրակապերը՝ խոցերի չափը նվազեցնելու համար30:
Արծաթի որոշակի ձևեր և կոնցենտրացիաներ նախկինում in vitro փորձարկումներում ցույց են տրվել ցիտոտոքսիկություն 11, սակայն այս in vitro արդյունքները միշտ չէ, որ in vivo պայմաններում անբարենպաստ ազդեցություններ են առաջացնում: Բացի այդ, արծաթի տեխնոլոգիայի առաջընթացը և վիրակապերի մեջ արծաթի միացությունների ու կոնցենտրացիաների ավելի լավ ըմբռնումը հանգեցրել են բազմաթիվ անվտանգ և արդյունավետ արծաթե վիրակապերի մշակմանը: Այնուամենայնիվ, արծաթե վիրակապերի տեխնոլոգիայի զարգացմանը զուգընթաց կարևոր է հասկանալ այս վիրակապերի ազդեցությունը վերքի միջավայրի վրա31,32,33: Նախկինում հաղորդվել էր, որ վերէպիթելիզացիայի արագության աճը համապատասխանում է հակաբորբոքային M2 մակրոֆագերի աճող համամասնությանը՝ համեմատած բորբոքում առաջացնող M1 ֆենոտիպի հետ: Սա նկատվել էր նախորդ մկների մոդելում, որտեղ արծաթե հիդրոգելային վերքի վիրակապերը համեմատվել են արծաթե սուլֆադիազինի և ոչ հակամանրէային հիդրոգելերի հետ34:
Քրոնիկ վերքերը կարող են ցուցաբերել չափազանց բորբոքում, և նկատվել է, որ նեյտրոֆիլների ավելցուկի առկայությունը կարող է վնասակար լինել վերքերի լավացման համար35: Նեյտրոֆիլներից զուրկ մկների վրա կատարված ուսումնասիրության ժամանակ նեյտրոֆիլների առկայությունը հետաձգել է վերէպիթելիզացիան: Նեյտրոֆիլների ավելցուկի առկայությունը հանգեցնում է պրոտեազների և ռեակտիվ թթվածնային տեսակների, ինչպիսիք են սուպերօքսիդը և ջրածնի պերօքսիդը, բարձր մակարդակի, որոնք կապված են քրոնիկ և դանդաղ լավացող վերքերի հետ37,38: Նմանապես, մակրոֆագերի թվի աճը, եթե չվերահսկվի, կարող է հանգեցնել վերքերի լավացման ուշացման39: Այս աճը հատկապես կարևոր է, եթե մակրոֆագերը չեն կարողանում անցում կատարել բորբոքային ֆենոտիպից դեպի լավացող ֆենոտիպ, ինչի արդյունքում վերքերը չեն կարողանում դուրս գալ լավացման բորբոքային փուլից40: Մենք նկատել ենք նեյտրոֆիլների և մակրոֆագերի նվազում կենսաթաղանթով վարակված վերքերում բոլոր արծաթե վիրակապերով 3 օրվա բուժումից հետո, բայց նվազումն ավելի ցայտուն էր թթվածնով հարստացված աղային վիրակապերի դեպքում: Այս նվազումը կարող է լինել արծաթի նկատմամբ իմունային պատասխանի, կենսաբեռի նվազման պատասխանի, կամ վերքի ապաքինման ուշ փուլում գտնվելու և, հետևաբար, վերքում իմունային բջիջների քանակի նվազման անմիջական արդյունք։ Վերքում բորբոքային բջիջների թվի նվազումը կարող է պահպանել վերքի ապաքինմանը նպաստող միջավայր։ Ag օքսիաղերի ազդեցության մեխանիզմը, թե ինչպես են դրանք խթանում վարակից անկախ ապաքինումը, պարզ չէ, բայց Ag օքսիաղերի թթվածին արտադրելու և բորբոքման միջնորդի՝ ջրածնի պերօքսիդի վնասակար մակարդակները ոչնչացնելու ունակությունը կարող է բացատրել սա և պահանջում է հետագա ուսումնասիրություն17։
Քրոնիկ չբուժվող վարակված վերքերը խնդիր են ստեղծում թե՛ բժիշկների, թե՛ հիվանդների համար: Չնայած շատ վիրակապերի պնդումներ կան հակամանրէային արդյունավետության մասին, հետազոտությունները հազվադեպ են կենտրոնանում վերքի միկրոմիջավայրին ազդող այլ հիմնական գործոնների վրա: Այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ արծաթի տարբեր տեխնոլոգիաները ունեն տարբեր հակամանրէային արդյունավետություն և, ամենակարևորը, տարբեր ազդեցություններ վերքի միջավայրի և բուժման վրա՝ անկախ վարակից: Չնայած այս in vitro և in vivo ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս այս վիրակապերի արդյունավետությունը վերքերի վարակների բուժման և բուժումը խթանելու գործում, անհրաժեշտ են պատահականացված վերահսկվող փորձարկումներ՝ կլինիկայում այս վիրակապերի արդյունավետությունը գնահատելու համար:
Ընթացիկ ուսումնասիրության ընթացքում օգտագործված և/կամ վերլուծված տվյալների հավաքածուները հասանելի են համապատասխան հեղինակից՝ ողջամիտ պահանջի դեպքում։