Մարդու կմախքային մկանային մանրաթելերի տարասեռությունը միոզինի ծանր շղթայից այն կողմ

Շնորհակալություն nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի CSS-ի սահմանափակ աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել դիտարկիչի վերջին տարբերակը (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Բացի այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար այս կայքը զերծ կլինի ոճերից և JavaScript-ից:
Կմախքային մկանները տարասեռ հյուսվածք են, որը հիմնականում կազմված է միոֆիբրիլներից, որոնք մարդկանց մոտ սովորաբար դասակարգվում են երեք տեսակի՝ մեկ «դանդաղ» (տիպ 1) և երկու «արագ» (տիպեր 2A և 2X): Այնուամենայնիվ, ավանդական միոֆիբրիլների միջև և դրանց ներսում տարասեռությունը դեռևս վատ է հասկացված: Մենք կիրառեցինք տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ մոտեցումներ համապատասխանաբար մարդու vastus lateralis-ի 1050 և 1038 առանձին միոֆիբրիլների նկատմամբ: Պրոտեոմիկ ուսումնասիրությունը ներառում էր տղամարդիկ, իսկ տրանսկրիպտոմիկ ուսումնասիրությունը՝ 10 տղամարդ և 2 կին: Միոզինի ծանր շղթայի իզոֆորմներից բացի, մենք նույնականացրեցինք նյութափոխանակության սպիտակուցները, ռիբոսոմային սպիտակուցները և բջջային միացքային սպիտակուցները որպես բազմաչափ միջմիոֆիբրիլային փոփոխականության աղբյուրներ: Ավելին, չնայած դանդաղ և արագ մանրաթելերի կլաստերների նույնականացմանը, մեր տվյալները ենթադրում են, որ 2X տիպի մանրաթելերը ֆենոտիպորեն անզանազանելի են այլ արագ կծկվող մանրաթելերից: Ավելին, միոզինի ծանր շղթայի վրա հիմնված դասակարգումը բավարար չէ նեմալինային միոպաթիաների դեպքում միոֆիբրի ֆենոտիպը նկարագրելու համար: Ընդհանուր առմամբ, մեր տվյալները ենթադրում են բազմաչափ միոֆիբրերի տարասեռություն, որի տատանման աղբյուրները տարածվում են միոզինի ծանր շղթայի իզոֆորմներից այն կողմ։
Բջջային տարասեռությունը բոլոր կենսաբանական համակարգերի բնորոշ առանձնահատկությունն է, որը թույլ է տալիս բջիջներին մասնագիտանալ հյուսվածքների և բջիջների տարբեր կարիքները բավարարելու համար:1 Կմախքային մկանային մանրաթելերի տարասեռության վերաբերյալ ավանդական տեսակետն այն է, որ շարժիչ նեյրոնները որոշում են մանրաթելի տեսակը շարժիչ միավորի ներսում, և որ մանրաթելի տեսակը (այսինքն՝ մարդկանց մոտ 1-ին, 2A-րդ և 2X-րդ տիպերը) որոշվում է միոզինի ծանր շղթայի (MYH) իզոֆորմների բնութագրերով:2 Սա սկզբում հիմնված էր դրանց pH ATPase անկայունության վրա,3,4 իսկ ավելի ուշ՝ MYH-ի մոլեկուլային արտահայտության վրա:5 Այնուամենայնիվ, «խառը» մանրաթելերի նույնականացման և հետագա ընդունման հետ մեկտեղ, որոնք տարբեր համամասնություններով համատեղ արտահայտում են բազմաթիվ MYH-ներ, կմախքային մկանային մանրաթելերը ավելի ու ավելի են դիտվում որպես շարունակականություն, այլ ոչ թե որպես առանձին մանրաթելերի տեսակներ:6 Չնայած դրան, ոլորտը դեռևս մեծապես հենվում է MYH-ի վրա որպես միոֆիբրերի դասակարգման հիմնական դասակարգիչ, տեսակետ, որը, հավանաբար, ազդվել է կրծողների վաղ ուսումնասիրությունների սահմանափակումներից և զգալի կողմնակալություններից, որոնց MYH արտահայտման պրոֆիլները և մանրաթելերի տեսակների շրջանակը տարբերվում են մարդկանցից:2 Իրավիճակն ավելի է բարդանում այն ​​​​փաստով, որ մարդու տարբեր կմախքային մկանները ցուցաբերում են մանրաթելերի տեսակների բազմազան տեսականի:7 vastus lateralis-ը խառը մկան է՝ MYH-ի միջանկյալ (և, հետևաբար, ներկայացուցչական) արտահայտման պրոֆիլով։7 Ավելին, նմուշառման հեշտությունը այն դարձնում է մարդկանց մեջ ամենալավ ուսումնասիրված մկանը։
Այսպիսով, կմախքային մկանային մանրաթելերի բազմազանության անաչառ ուսումնասիրությունը հզոր «օմիկ» գործիքների միջոցով կարևոր է, բայց նաև մարտահրավերային, մասամբ կմախքային մկանային մանրաթելերի բազմամիջուկային բնույթի պատճառով: Այնուամենայնիվ, վերջին տարիներին տրանսկրիպտոմիկայի8,9 և պրոտեոմիկայի10 տեխնոլոգիաները զգայունության հեղափոխություն են ապրել տարբեր տեխնոլոգիական առաջընթացների շնորհիվ, որոնք թույլ են տալիս վերլուծել կմախքային մկանները մեկ մանրաթելի լուծաչափով: Արդյունքում, զգալի առաջընթաց է գրանցվել մեկ մանրաթելի բազմազանության և դրանց ատրոֆիկ խթանների և ծերացման նկատմամբ արձագանքի բնութագրման գործում11,12,13,14,15,16,17,18: Կարևոր է, որ այս տեխնոլոգիական առաջընթացներն ունեն կլինիկական կիրառություններ, որոնք թույլ են տալիս ավելի մանրամասն և ճշգրիտ բնութագրել հիվանդության հետ կապված դիսռեգուլյացիան: Օրինակ, նեմալինային միոպաթիայի պաթոֆիզիոլոգիան, որը ամենատարածված ժառանգական մկանային հիվանդություններից մեկն է (MIM 605355 և MIM 161800), բարդ և շփոթեցնող է:19,20 Հետևաբար, կմախքային մկանային մանրաթելերի դիսռեգուլյացիայի ավելի լավ բնութագրումը կարող է հանգեցնել այս հիվանդության մեր ըմբռնման զգալի առաջընթացի:
Մենք մշակել ենք մարդու բիոպսիայի նմուշներից ձեռքով մեկուսացված առանձին կմախքային մկանային մանրաթելերի տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ վերլուծության մեթոդներ և կիրառել դրանք հազարավոր մանրաթելերի վրա, ինչը թույլ է տալիս մեզ ուսումնասիրել մարդու կմախքային մկանային մանրաթելերի բջջային տարասեռությունը: Այս աշխատանքի ընթացքում մենք ցույց տվեցինք մկանային մանրաթելերի տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ ֆենոտիպավորման հզորությունը և նույնականացրինք նյութափոխանակային, ռիբոսոմային և բջջային միացքային սպիտակուցները որպես միջմանրաթելային փոփոխականության նշանակալի աղբյուրներ: Ավելին, այս պրոտեոմիկ աշխատանքային հոսքի միջոցով մենք բնութագրեցինք նեմատոդային միոպաթիայի կլինիկական նշանակությունը առանձին կմախքային մկանային մանրաթելերում՝ բացահայտելով համակարգված տեղաշարժ դեպի ոչ օքսիդատիվ մանրաթելեր՝ անկախ մանրաթելի տեսակից՝ հիմնվելով MYH-ի վրա:
Մարդու կմախքային մկանային մանրաթելերի տարասեռությունը հետազոտելու համար մենք մշակեցինք երկու աշխատանքային հոսքեր՝ առանձին կմախքային մկանային մանրաթելերի տրանսկրիպտոմային և պրոտեոմային վերլուծությունը հնարավոր դարձնելու համար (Նկար 1Ա և Լրացուցիչ Նկար 1Ա): Մենք մշակեցինք և օպտիմալացրինք մի քանի մեթոդաբանական քայլեր՝ նմուշի պահպանումից և ՌՆԹ-ի ու սպիտակուցի ամբողջականության պահպանումից մինչև յուրաքանչյուր մոտեցման համար թողունակության օպտիմալացումը: Տրանսկրիպտոմային վերլուծության համար դա իրականացվեց հակադարձ տրանսկրիպցիայի սկզբնական փուլում նմուշին հատուկ մոլեկուլային շտրիխ կոդեր տեղադրելով, ինչը թույլ տվեց 96 մանրաթել միավորել արդյունավետ հետագա մշակման համար: Ավելի խորը հաջորդականացումը (±1 միլիոն ընթերցում մեկ մանրաթելի համար)՝ համեմատած ավանդական միաբջիջ մոտեցումների հետ, ավելի հարստացրեց տրանսկրիպտոմային տվյալները:21 Պրոտեոմիկայի համար մենք օգտագործեցինք կարճ քրոմատոգրաֆիկ գրադիենտ (21 րոպե)՝ զուգորդված DIA-PASEF տվյալների ձեռքբերման հետ timsTOF զանգվածային սպեկտրոմետրի վրա՝ պրոտեոմի խորությունը օպտիմալացնելու և բարձր թողունակությունը պահպանելու համար: 22,23 Առողջ կմախքային մկանային մանրաթելերի տարասեռությունը հետազոտելու համար մենք բնութագրել ենք 14 առողջ չափահաս դոնորների 1050 առանձին մանրաթելերի տրանսկրիպտոմները և 5 առողջ չափահաս դոնորների 1038 մանրաթելերի պրոտեոմները (Լրացուցիչ աղյուսակ 1): Այս հոդվածում այս տվյալների հավաքածուները համապատասխանաբար անվանում ենք 1000 մանրաթելից բաղկացած տրանսկրիպտոմներ և պրոտեոմներ: Մեր մոտեցումը 1000 մանրաթելից բաղկացած տրանսկրիպտոմային և պրոտեոմային վերլուծություններում հայտնաբերել է ընդհանուր առմամբ 27,237 տրանսկրիպտ և 2,983 սպիտակուց (Նկար 1Ա, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածուներ 1-2): Տրանսկրիպտոմային և պրոտեոմային տվյալների հավաքածուները >1000 հայտնաբերված գեների և մանրաթելի 50% վավեր արժեքների համար զտելուց հետո, հետագա կենսաինֆորմատիկ վերլուծություններ են կատարվել համապատասխանաբար տրանսկրիպտոմում և պրոտեոմում 925 և 974 մանրաթելերի համար: Ֆիլտրումից հետո, յուրաքանչյուր մանրաթելի համար հայտնաբերվել է միջինում 4257 ± 1557 գեն և 2015 ± 234 սպիտակուց (միջին ± ստանդարտ շեղում), սահմանափակ անհատական ​​փոփոխականությամբ (Լրացուցիչ նկարներ 1B–C, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածուներ 3–4): Այնուամենայնիվ, մասնակիցների միջև փոփոխականությունն ավելի ցայտուն էր, հավանաբար տարբեր երկարությունների և լայնական հատույթի մակերեսների մանրաթելերի միջև ՌՆԹ/սպիտակուցի բերքատվության տարբերությունների պատճառով: Սպիտակուցների մեծ մասի համար (>2000) փոփոխականության գործակիցը 20%-ից ցածր էր (Լրացուցիչ նկար 1D): Երկու մեթոդներն էլ թույլ տվեցին գրանցել տրանսկրիպտների և սպիտակուցների լայն դինամիկ տիրույթ՝ մկանների կծկման համար կարևոր բարձր արտահայտված ստորագրություններով (օրինակ՝ ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Լրացուցիչ նկարներ 1E–F): Հայտնաբերված առանձնահատկությունների մեծ մասը ընդհանուր էին տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ տվյալների հավաքածուների միջև (Լրացուցիչ նկար 1G), և այդ առանձնահատկությունների միջին UMI/LFQ ինտենսիվությունները բավականին լավ փոխկապակցված էին (r = 0.52) (Լրացուցիչ նկար 1H):
Տրանսկրիպտոմիկայի և պրոտեոմիկայի աշխատանքային հոսք (ստեղծվել է BioRender.com-ի միջոցով): BD MYH7, MYH2 և MYH1 դինամիկ միջակայքի կորեր և մանրաթելի տեսակի վերագրման հաշվարկված շեմեր: E, F MYH արտահայտման բաշխումը մանրաթելերի միջև տրանսկրիպտոմիկայի և պրոտեոմիկայի տվյալների հավաքածուներում: G, H Միատարր բազմազանության մոտավորության և պրոյեկցիայի (UMAP) գրաֆիկներ տրանսկրիպտոմիկայի և պրոտեոմիկայի համար, որոնք գունավորված են MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելի տեսակով: I, J Առանձնահատկություններ, որոնք ցույց են տալիս MYH7, MYH2 և MYH1 արտահայտությունը տրանսկրիպտոմիկայի և պրոտեոմիկայի տվյալների հավաքածուներում:
Սկզբում մենք որոշեցինք յուրաքանչյուր մանրաթելին վերագրել MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելի տեսակ՝ օգտագործելով օպտիմիզացված մոտեցում, որն օգտագործում է օմիկայի տվյալների հավաքածուներում MYH արտահայտման բարձր զգայունությունը և դինամիկ տիրույթը: Նախորդ ուսումնասիրություններում օգտագործվել են կամայական շեմեր՝ մանրաթելերը որպես մաքուր 1-ին տիպ, 2A տիպ, 2X տիպ կամ խառը պիտակավորելու համար՝ հիմնվելով տարբեր MYH-ների արտահայտման ֆիքսված տոկոսի վրա11,14,24: Մենք օգտագործել ենք այլ մոտեցում, որի դեպքում յուրաքանչյուր մանրաթելի արտահայտությունը դասակարգվել է մանրաթելերը տեսակավորելու համար օգտագործված MYH-ներով՝ MYH7, MYH2 և MYH1, որոնք համապատասխանում են համապատասխանաբար 1-ին, 2A տիպ և 2X տիպ մանրաթելերին: Այնուհետև մենք մաթեմատիկորեն հաշվարկել ենք յուրաքանչյուր արդյունքում ստացված կորի ստորին թեքման կետը և օգտագործել այն որպես շեմ՝ յուրաքանչյուր MYH-ի համար մանրաթելերը դրական (շեմից բարձր) կամ բացասական (շեմից ցածր) վերագրելու համար (Նկար 1B–D): Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ MYH7-ը (Նկար 1B) և MYH2-ը (Նկար 1C) ունեն ավելի տարբեր միացված/անջատված արտահայտման պրոֆիլներ ՌՆԹ մակարդակում՝ համեմատած սպիտակուցի մակարդակի հետ: Իրոք, սպիտակուցային մակարդակում շատ քիչ մանրաթելեր չէին արտահայտում MYH7, և ոչ մի մանրաթել չուներ MYH2-ի 100% արտահայտություն: Այնուհետև մենք օգտագործեցինք նախապես որոշված ​​արտահայտման շեմեր՝ յուրաքանչյուր տվյալների հավաքածուի բոլոր մանրաթելերին MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելերի տեսակները վերագրելու համար: Օրինակ, MYH7+/MYH2-/MYH1- մանրաթելերը վերագրվեցին 1-ին տիպին, մինչդեռ MYH7-/MYH2+/MYH1+ մանրաթելերը վերագրվեցին խառը 2A/2X տիպին (տե՛ս լրացուցիչ աղյուսակ 2-ը՝ ամբողջական նկարագրության համար): Բոլոր մանրաթելերը համատեղելով՝ մենք նկատեցինք MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելերի տեսակների զարմանալիորեն նման բաշխում՝ թե՛ ՌՆԹ-ի (Նկար 1E), թե՛ սպիտակուցի (Նկար 1F) մակարդակներում, մինչդեռ MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելերի տեսակների հարաբերական կազմը, ինչպես և սպասվում էր, տարբերվում էր անհատների մոտ (Լրացուցիչ նկար 2A): Մանրաթելերի մեծ մասը դասակարգվել է որպես մաքուր 1-ին տիպի (34–35%) կամ 2A տիպի (36–38%), չնայած հայտնաբերվել է նաև խառը 2A/2X տիպի մանրաթելերի զգալի քանակ (16–19%): Ակնհայտ տարբերությունն այն է, որ մաքուր 2X տիպի մանրաթելերը կարող են հայտնաբերվել միայն ՌՆԹ մակարդակում, բայց ոչ սպիտակուցային մակարդակում, ինչը ենթադրում է, որ MYH-ի արագ էքսպրեսիան առնվազն մասամբ կարգավորվում է տրանսկրիպցիայից հետո։
Մենք վավերացրեցինք մեր պրոտեոմիկայի վրա հիմնված MYH մանրաթելերի տիպավորման մեթոդը՝ օգտագործելով հակամարմինների վրա հիմնված կետային բլոտինգ, և երկու մեթոդներն էլ հասան 100% համաձայնության՝ մաքուր 1-ին և 2A տիպի մանրաթելերը նույնականացնելու հարցում (տե՛ս լրացուցիչ նկար 2B): Այնուամենայնիվ, պրոտեոմիկայի վրա հիմնված մոտեցումն ավելի զգայուն էր, ավելի արդյունավետ՝ խառը մանրաթելերը նույնականացնելու և յուրաքանչյուր մանրաթելում յուրաքանչյուր MYH գենի համամասնությունը քանակականացնելու հարցում: Այս տվյալները ցույց են տալիս կմախքային մկանային մանրաթելերի տեսակները բնութագրելու համար օբյեկտիվ, բարձր զգայուն օմիկայի վրա հիմնված մոտեցման օգտագործման արդյունավետությունը:
Այնուհետև մենք օգտագործեցինք տրանսկրիպտոմիկայի և պրոտեոմիկայի կողմից տրամադրված համակցված տեղեկատվությունը միոթելերը օբյեկտիվորեն դասակարգելու համար՝ հիմնվելով դրանց ամբողջական տրանսկրիպտոմի կամ պրոտեոմի վրա: Օգտագործելով միատարր բազմաձև մոտարկման և պրոյեկցիայի (UMAP) մեթոդը՝ չափողականությունը վեց հիմնական բաղադրիչների կրճատելու համար (Լրացուցիչ նկարներ 3A–B), մենք կարողացանք պատկերացնել միոթելերի փոփոխականությունը տրանսկրիպտոմում (Նկար 1G) և պրոտեոմում (Նկար 1H): Հատկանշական է, որ միոթելերը չեն խմբավորվել մասնակիցների (Լրացուցիչ նկարներ 3C–D) կամ փորձարկման օրերի (Լրացուցիչ նկար 3E) կողմից ո՛չ տրանսկրիպտոմիկայի, ո՛չ էլ պրոտեոմիկայի տվյալների հավաքածուներում, ինչը ենթադրում է, որ կմախքային մկանային մանրաթելերի փոփոխականությունը մասնակիցների ներսում ավելի բարձր է, քան մասնակիցների միջև: UMAP գրաֆիկում ի հայտ եկան «արագ» և «դանդաղ» միոթելերը ներկայացնող երկու տարբեր կլաստերներ (Նկարներ 1G–H): MYH7+ (դանդաղ) միոթելերը կլաստերացված էին UMAP1-ի դրական բևեռում, մինչդեռ MYH2+ և MYH1+ (արագ) միոթելերը կլաստերացված էին UMAP1-ի բացասական բևեռում (Նկարներ 1I–J): Այնուամենայնիվ, MYH արտահայտության հիման վրա արագ կծկվող մանրաթելերի տեսակների (այսինքն՝ 2A տիպ, 2X տիպ կամ խառը 2A/2X) միջև տարբերակում չի կատարվել, ինչը ենթադրում է, որ MYH1 (Նկար 1I–J) կամ այլ դասական 2X միոթելերի մարկերներ, ինչպիսիք են ACTN3-ը կամ MYLK2-ը (Լրացուցիչ նկարներ 4A–B) արտահայտությունը չի տարբերակում միոթելերի տարբեր տեսակները՝ դիտարկելով ամբողջական տրանսկրիպտոմը կամ պրոտեոմը: Ավելին, MYH2-ի և MYH7-ի համեմատ, քիչ տրանսկրիպտներ կամ սպիտակուցներ դրականորեն կապված էին MYH1-ի հետ (Լրացուցիչ նկարներ 4C–H), ինչը ենթադրում է, որ MYH1 առատությունը լիովին չի արտացոլում միոթելերի տրանսկրիպտոմը/պրոտեոմը: Նմանատիպ եզրակացությունների են հանգել նաև երեք MYH իզոֆորմների խառը արտահայտությունը UMAP մակարդակում գնահատելիս (Լրացուցիչ նկ. 4I–J): Այսպիսով, մինչդեռ 2X մանրաթելերը կարող են նույնականացվել տրանսկրիպտի մակարդակում՝ միայն MYH քանակականացման հիման վրա, MYH1+ մանրաթելերը չեն տարբերվում այլ արագ մանրաթելերից՝ ամբողջ տրանսկրիպտոմը կամ պրոտեոմը դիտարկելիս:
Որպես MYH-ից դուրս դանդաղ մանրաթելերի տարասեռության նախնական ուսումնասիրություն, մենք գնահատեցինք չորս հաստատված դանդաղ մանրաթելերի տիպին հատուկ սպիտակուցներ՝ TPM3, TNNT1, MYL3 և ATP2A22: Դանդաղ մանրաթելերի ենթատիպերը ցույց տվեցին բարձր, թեև ոչ կատարյալ, Պիրսոնի կորելյացիաներ MYH7-ի հետ՝ թե՛ տրանսկրիպտոմիկայի (Լրացուցիչ նկար 5A), թե՛ պրոտեոմիկայի (Լրացուցիչ նկար 5B) մեջ: Դանդաղ մանրաթելերի մոտավորապես 25%-ը և 33%-ը համապատասխանաբար չեն դասակարգվել որպես մաքուր դանդաղ մանրաթելեր՝ բոլոր գեների/սպիտակուցային ենթատիպերի կողմից տրանսկրիպտոմիկայի (Լրացուցիչ նկար 5C) և պրոտեոմիկայի (Լրացուցիչ նկար 5D) մեջ: Հետևաբար, բազմաթիվ գեների/սպիտակուցային ենթատիպերի վրա հիմնված դանդաղ մանրաթելերի դասակարգումը ներմուծում է լրացուցիչ բարդություն, նույնիսկ մանրաթելերի տիպին հատուկ համարվող սպիտակուցների համար: Սա ենթադրում է, որ մեկ գենի/սպիտակուցային ընտանիքի իզոֆորմների վրա հիմնված մանրաթելերի դասակարգումը կարող է բավարար չափով չարտացոլել կմախքային մկանային մանրաթելերի իրական տարասեռությունը:
Մարդու կմախքային մկանային մանրաթելերի ֆենոտիպային փոփոխականությունը ամբողջ օմիկայի մոդելի մասշտաբով ավելի խորը ուսումնասիրելու համար մենք իրականացրինք տվյալների անաչառ չափողականության նվազեցում՝ օգտագործելով գլխավոր բաղադրիչների վերլուծություն (PCA) (Նկար 2A): UMAP գրաֆիկների նման, ո՛չ մասնակիցը, ո՛չ էլ փորձարկման օրը չեն ազդել PCA մակարդակում մանրաթելերի կլաստերացման վրա (Լրացուցիչ նկարներ 6A–C): Երկու տվյալների հավաքածուներում էլ MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելի տեսակը բացատրվել է PC2-ով, որը ցույց է տվել դանդաղ կծկվող տիպի 1 մանրաթելերի կլաստեր և երկրորդ կլաստեր, որը պարունակում է արագ կծկվող տիպի 2A, տիպի 2X և խառը 2A/2X մանրաթելեր (Նկար 2A): Երկու տվյալների հավաքածուներում էլ այս երկու կլաստերները միացված էին խառը տիպի 1/2A մանրաթելերի փոքր թվով: Ինչպես և սպասվում էր, հիմնական PC շարժիչների գերներկայացվածության վերլուծությունը հաստատեց, որ PC2-ը ղեկավարվում է կծկվող և նյութափոխանակության ստորագրություններով (Նկար 2B և լրացուցիչ նկարներ 6D–E, լրացուցիչ տվյալների հավաքածուներ 5–6): Ընդհանուր առմամբ, MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելի տեսակը բավարար էր PC2-ի երկայնքով անընդհատ տատանումները բացատրելու համար, բացառությամբ այսպես կոչված 2X մանրաթելերի, որոնք տարածված էին տրանսկրիպտոմի ողջ տարածքում՝ արագ կլաստերի ներսում։
Ա. Տրանսկրիպտոմների և պրոտեոմների տվյալների հավաքածուների գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) գրաֆիկներ, որոնք գունավորվել են ըստ մանրաթելի տեսակի՝ հիմնվելով MYH-ի վրա։ Բ. PC2-ում և PC1-ում տրանսկրիպտի և սպիտակուցի դրայվերների հարստացման վերլուծություն։ Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է clusterProfiler փաթեթի և Benjamini-Hochberg-ի կողմից ճշգրտված p-արժեքների միջոցով։ Գ, Դ. PCA գրաֆիկներ, որոնք գունավորվել են ըստ միջբջջային ադհեզիայի գեների օնտոլոգիայի (GO) տերմինների տրանսկրիպտոմում և կոստամերի GO տերմիններում պրոտեոմում։ Սլաքները ներկայացնում են տրանսկրիպտի և սպիտակուցի դրայվերները և դրանց ուղղությունները։ Ե, Զ. Կլինիկորեն նշանակալի առանձնահատկությունների միատեսակ բազմաձև մոտարկման և պրոյեկցիայի (UMAP) առանձնահատկությունների գրաֆիկներ, որոնք ցույց են տալիս էքսպրեսիայի գրադիենտներ՝ անկախ դանդաղ/արագ մանրաթելի տեսակից։ Գ, Հ. Տրանսկրիպտոմներում և պրոտեոմներում PC2 և PC1 դրայվերների միջև փոխհարաբերությունները։
Անսպասելիորեն, MYH-ի վրա հիմնված միոֆիբրի տեսակը բացատրեց փոփոխականության միայն երկրորդ ամենաբարձր աստիճանը (PC2), ինչը ենթադրում է, որ MYH-ի վրա հիմնված միոֆիբրի տիպի (PC1) հետ կապ չունեցող այլ կենսաբանական գործոններ կարևոր դեր են խաղում կմախքային մկանային մանրաթելերի տարասեռության կարգավորման գործում: PC1-ի հիմնական շարժիչ ուժերի գերներկայացվածության վերլուծությունը ցույց տվեց, որ PC1-ի փոփոխականությունը հիմնականում որոշվում էր տրանսկրիպտոմում բջիջ-բջիջ ադհեզիայով և ռիբոսոմի պարունակությամբ, ինչպես նաև պրոտեոմում կոստամերներով և ռիբոսոմային սպիտակուցներով (Նկար 2B և լրացուցիչ նկարներ 6D–E, լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 7): Կմախքային մկաններում կոստամերները Z-սկավառակը միացնում են սարկոլեմային և մասնակցում են ուժի փոխանցմանը և ազդանշանային գործընթացներին: 25 Բջիջ-բջիջ ադհեզիայի (տրանսկրիպտոմ, նկար 2C) և կոստամերի (պրոտեոմ, նկար 2D) առանձնահատկություններ օգտագործող մեկնաբանված PCA գրաֆիկները ցույց տվեցին PC1-ի ուժեղ ձախ շեղում, ինչը ցույց է տալիս, որ այս առանձնահատկությունները հարստացված են որոշակի մանրաթելերում:
UMAP մակարդակում միոֆիբրերի կլաստերացման ավելի մանրամասն ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ առանձնահատկությունների մեծ մասը ցուցաբերում է միոֆիբրերի տեսակից անկախ MYH-ի վրա հիմնված արտահայտման գրադիենտ, այլ ոչ թե միոֆիբրերի ենթակլաստերին բնորոշ։ Այս շարունակականությունը նկատվել է պաթոլոգիական վիճակների հետ կապված մի քանի գեների համար (Նկար 2E), ինչպիսիք են CHCHD10-ը (նյարդամկանային հիվանդություն), SLIT3-ը (մկանային ատրոֆիա), CTDNEP1-ը (մկանային հիվանդություն)։ Այս շարունակականությունը նկատվել է նաև պրոտեոմի մեջ, ներառյալ նյարդաբանական խանգարումների (UGDH), ինսուլինային ազդանշանային (PHIP) և տրանսկրիպցիայի (HIST1H2AB) հետ կապված սպիտակուցները (Նկար 2F)։ Միասին, այս տվյալները ցույց են տալիս մանրաթելերի տեսակից անկախ դանդաղ/արագ կծկումների տարասեռության շարունակականությունը տարբեր միոֆիբրերի միջև։
Հետաքրքիր է, որ PC2-ի շարժիչ գեները ցույց տվեցին տրանսկրիպտոմ-պրոտեոմ լավ համակցություն (r = 0.663) (Նկար 2G), ինչը ենթադրում է, որ դանդաղ և արագ կծկվող մանրաթելերի տեսակները, և մասնավորապես կմախքային մկանային մանրաթելերի կծկվող և նյութափոխանակության հատկությունները, կարգավորվում են տրանսկրիպցիոն եղանակով: Այնուամենայնիվ, PC1-ի շարժիչ գեները չեն ցույց տվել տրանսկրիպտոմ-պրոտեոմ համակցություն (r = -0.027) (Նկար 2H), ինչը ենթադրում է, որ դանդաղ/արագ կծկվող մանրաթելերի տեսակների հետ կապ չունեցող տատանումները մեծապես կարգավորվում են տրանսկրիպցիայից հետո: Քանի որ PC1-ի տատանումները հիմնականում բացատրվում էին ռիբոսոմային գեների օնտոլոգիայի տերմիններով, և հաշվի առնելով, որ ռիբոսոմները կարևոր և մասնագիտացված դեր են խաղում բջջում՝ ակտիվորեն մասնակցելով և ազդելով սպիտակուցի թարգմանության վրա,31 մենք հաջորդիվ սկսեցինք ուսումնասիրել այս անսպասելի ռիբոսոմային տարասեռությունը:
Սկզբում մենք գունավորեցինք պրոտեոմիկայի գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության գրաֆիկը՝ համաձայն GOCC «ցիտոպլազմային ռիբոսոմ» տերմինում սպիտակուցների հարաբերական առատության (Նկար 3Ա): Չնայած այս տերմինը հարստացված է PC1-ի դրական կողմից, ինչը հանգեցնում է փոքր գրադիենտի, ռիբոսոմային սպիտակուցները խթանում են PC1-ի բաժանումը երկու ուղղություններով էլ (Նկար 3Ա): PC1-ի բացասական կողմից հարստացված ռիբոսոմային սպիտակուցների թվում էին RPL18-ը, RPS18-ը և RPS13-ը (Նկար 3Բ), մինչդեռ RPL31-ը, RPL35-ը և RPL38-ը (Նկար 3Գ) PC1-ի դրական կողմի հիմնական շարժիչ ուժերն էին: Հետաքրքիր է, որ RPL38-ը և RPS13-ը բարձր արտահայտված էին կմախքային մկաններում՝ համեմատած այլ հյուսվածքների հետ (Լրացուցիչ նկար 7Ա): PC1-ում այս տարբերակիչ ռիբոսոմային ստորագրությունները չեն դիտարկվել տրանսկրիպտոմում (Լրացուցիչ նկար 7Բ), ինչը վկայում է հետտրանսկրիպցիոն կարգավորման մասին:
Ա. Պրոտոմի վրա ցիտոպլազմային ռիբոսոմային գեների օնտոլոգիայի (GO) տերմինների համաձայն գունավորված գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (ԳԿՎ) գրաֆիկ: ԳԿՎ գրաֆիկում սլաքները ցույց են տալիս սպիտակուցային միջնորդավորված տատանումների ուղղությունը: Գծի երկարությունը համապատասխանում է տվյալ սպիտակուցի գլխավոր բաղադրիչների գնահատականին: Բ, Գ. RPS13-ի և RPL38-ի ԳԿՎ առանձնահատկությունների գրաֆիկներ: Դ. Ցիտոպլազմային ռիբոսոմային սպիտակուցների չվերահսկվող հիերարխիկ կլաստերացման վերլուծություն: Ե. 80S ռիբոսոմի կառուցվածքային մոդելը (PDB: 4V6X), որը ընդգծում է կմախքային մկանային մանրաթելերում տարբեր առատությամբ ռիբոսոմային սպիտակուցները: Զ. mRNA ելքային ալիքի մոտ տեղակայված տարբեր ստեխիոմետրիայով ռիբոսոմային սպիտակուցներ:
Ռիբոսոմային տարասեռության և մասնագիտացման հասկացությունները նախկինում առաջարկվել են, որոնց համաձայն՝ տարբեր ռիբոսոմային ենթապոպուլյացիաների առկայությունը (ռիբոսոմային տարասեռություն) կարող է անմիջականորեն ազդել սպիտակուցի թարգմանության վրա տարբեր հյուսվածքներում32 և բջիջներում33՝ mRNA տրանսկրիպտների խմբերի ընտրողական թարգմանության միջոցով34 (ռիբոսոմային մասնագիտացում): Կմախքային մկանային մանրաթելերում համատեղ արտահայտված ռիբոսոմային սպիտակուցների ենթապոպուլյացիաները բացահայտելու համար մենք իրականացրեցինք պրոտեոմում ռիբոսոմային սպիտակուցների չվերահսկվող հիերարխիկ կլաստերացման վերլուծություն (Նկար 3D, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 8): Ինչպես և սպասվում էր, ռիբոսոմային սպիտակուցները չեն կլաստերացվել մանրաթելի տեսակի հիման վրա՝ հիմնվելով MYH-ի վրա: Այնուամենայնիվ, մենք նույնականացրել ենք ռիբոսոմային սպիտակուցների երեք տարբեր կլաստերներ. առաջին կլաստերը (ռիբոսոմային_կլաստեր_1) համատեղ կարգավորվում է RPL38-ի հետ և, հետևաբար, ունի աճող արտահայտություն դրական PC1 պրոֆիլ ունեցող մանրաթելերում: Երկրորդ կլաստերը (ռիբոսոմային_կլաստեր_2) համատեղ կարգավորվում է RPS13-ի հետ և բարձրանում է բացասական PC1 պրոֆիլ ունեցող մանրաթելերում: Երրորդ կլաստերը (ribosomal_cluster_3) չի ցուցաբերում համակարգված դիֆերենցիալ արտահայտություն կմախքային մկանային մանրաթելերում և կարող է համարվել կմախքային մկանների ռիբոսոմային սպիտակուցի «միջուկը»։ Երկու ռիբոսոմային կլաստերներն էլ՝ 1-ը և 2-ը, պարունակում են ռիբոսոմային սպիտակուցներ, որոնք նախկինում ցույց են տվել, որ կարգավորում են այլընտրանքային թարգմանությունը (օրինակ՝ RPL10A, RPL38, RPS19 և RPS25) և ֆունկցիոնալ ազդեցություն ունեն զարգացման վրա (օրինակ՝ RPL10A, RPL38):34,35,36,37,38 Համապատասխան PCA արդյունքներին, այս ռիբոսոմային սպիտակուցների դիտարկված տարասեռ ներկայացումը մանրաթելերի միջև նույնպես ցույց է տվել շարունակականություն (Լրացուցիչ նկար 7C):
Ռիբոսոմի ներսում տարասեռ ռիբոսոմային սպիտակուցների տեղակայումը պատկերացնելու համար մենք օգտագործել ենք մարդու 80S ռիբոսոմի կառուցվածքային մոդելը (Protein Data Bank: 4V6X) (Նկար 3E): Տարբեր ռիբոսոմային կլաստերներին պատկանող ռիբոսոմային սպիտակուցները մեկուսացնելուց հետո դրանց տեղակայումները մոտիկից չէին համընկնում, ինչը ենթադրում է, որ մեր մոտեցումը չի կարողացել հարստացնել ռիբոսոմի որոշակի շրջանները/ֆրակցիաները: Հետաքրքիր է, սակայն, որ կլաստեր 2-ում խոշոր ենթամիավորային սպիտակուցների համամասնությունը ավելի ցածր էր, քան կլաստեր 1-ում և 3-ում (Լրացուցիչ նկար 7D): Մենք նկատել ենք, որ կմախքային մկանային մանրաթելերում փոփոխված ստեխիոմետրիայով սպիտակուցները հիմնականում տեղայնացված էին ռիբոսոմի մակերեսին (Նկար 3E), ինչը համապատասխանում է տարբեր mRNA պոպուլյացիաներում ներքին ռիբոսոմի մուտքի վայրի (IRES) տարրերի հետ փոխազդելու նրանց ունակությանը, այդպիսով համակարգելով ընտրողական թարգմանությունը:40, 41 Ավելին, կմախքային մկանային մանրաթելերում փոփոխված ստեխիոմետրիայով շատ սպիտակուցներ տեղակայված էին ֆունկցիոնալ շրջանների մոտ, ինչպիսին է mRNA ելքի թունելը (Նկար 3F), որոնք ընտրողականորեն կարգավորում են որոշակի պեպտիդների թարգմանչական երկարացումը և կանգը: 42 Ամփոփելով՝ մեր տվյալները ենթադրում են, որ կմախքային մկանների ռիբոսոմային սպիտակուցների ստոիքիոմետրիան ցուցաբերում է տարասեռություն, ինչը հանգեցնում է կմախքային մկանային մանրաթելերի միջև տարբերությունների։
Հաջորդը մենք սկսեցինք արագ և դանդաղ կծկվող մանրաթելերի ստորագրությունները նույնականացնել և ուսումնասիրել դրանց տրանսկրիպցիոն կարգավորման մեխանիզմները: Համեմատելով UMAP-ի կողմից երկու տվյալների հավաքածուներում սահմանված արագ և դանդաղ կծկվող մանրաթելերի կլաստերները (Նկարներ 1G–H և 4A–B), տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ վերլուծությունները համապատասխանաբար նույնականացրին 1366 և 804 տարբեր առատ հատկանիշներ (Նկարներ 4A–B, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածուներ 9–12): Մենք դիտարկեցինք սարկոմերների (օրինակ՝ տրոպոմիոզին և տրոպոնին), գրգռման-կծկման կապի (SERCA իզոֆորմներ) և էներգիայի նյութափոխանակության (օրինակ՝ ALDOA և CKB) հետ կապված ստորագրությունների սպասվող տարբերությունները: Ավելին, սպիտակուցային ուբիկվիտինացիան կարգավորող տրանսկրիպտներն ու սպիտակուցները տարբեր կերպ էին արտահայտվում արագ և դանդաղ կծկվող մանրաթելերում (օրինակ՝ USP54, SH3RF2, USP28 և USP48) (Նկարներ 4A–B): Ավելին, մանրէային սպիտակուցի RP11-451G4.2 գենը (DWORF), որը նախկինում ցույց է տրվել գառան մկանային մանրաթելերի տարբեր տեսակների տարբեր ձևերով արտահայտվելու տարբերակով43 և ուժեղացնում է SERCA ակտիվությունը սրտամկանում44, զգալիորեն բարձրացել է դանդաղ կմախքային մկանային մանրաթելերում (Նկար 4A): Նմանապես, առանձին մանրաթելերի մակարդակում նշանակալի տարբերություններ են նկատվել հայտնի ստորագրություններում, ինչպիսիք են նյութափոխանակության հետ կապված լակտատ դեհիդրոգենազի իզոֆորմները (LDHA և LDHB, Նկար 4C և Լրացուցիչ Նկար 8A)45,46, ինչպես նաև նախկինում անհայտ մանրաթելի տեսակին բնորոշ ստորագրություններում (օրինակ՝ IRX3, USP54, USP28 և DPYSL3) (Նկար 4C): Տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ տվյալների հավաքածուների միջև կար տարբերակված արտահայտված առանձնահատկությունների զգալի համընկնում (Լրացուցիչ Նկար 8B), ինչպես նաև ծալքի փոփոխության կորելացիա, որը հիմնականում պայմանավորված էր սարկոմերի առանձնահատկությունների ավելի արտահայտված դիֆերենցիալ արտահայտությամբ (Լրացուցիչ Նկար 8C): Հատկանշական է, որ որոշ ստորագրություններ (օրինակ՝ USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ցույց են տվել ուժեղ հետտրանսկրիպցիոն կարգավորում միայն պրոտեոմային մակարդակում և ունեցել են դանդաղ/արագ կծկվող մանրաթելերի տիպին հատուկ արտահայտման պրոֆիլներ (Լրացուցիչ նկար 8C):
Ա և Բ հրաբխային գրաֆիկներ, որոնք համեմատում են դանդաղ և արագ կլաստերները, որոնք նույնականացվել են միատարր բազմաձև մոտարկման և պրոյեկցիայի (UMAP) գրաֆիկներով 1G–H նկարներում: Գունավոր կետերը ներկայացնում են տրանսկրիպտներ կամ սպիտակուցներ, որոնք զգալիորեն տարբերվում են FDR < 0.05 դեպքում, իսկ ավելի մուգ կետերը՝ տրանսկրիպտներ կամ սպիտակուցներ, որոնք զգալիորեն տարբերվում են log փոփոխության > 1 դեպքում: Երկկողմանի վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է DESeq2 Վալդի թեստի միջոցով՝ Բենջամինի-Հոխբերգի կողմից ճշգրտված p արժեքներով (տրանսկրիպտոմիկա) կամ Լիմմայի գծային մոդելի մեթոդի միջոցով՝ էմպիրիկ բայեսյան վերլուծությամբ, որին հաջորդել է Բենջամինի-Հոխբերգի ճշգրտում բազմակի համեմատությունների համար (պրոտեոմիկա): Գ Ընտրված տարբերակված արտահայտված գեների կամ սպիտակուցների ստորագրության գրաֆիկներ դանդաղ և արագ մանրաթելերի միջև: Դ Նշանակալիորեն տարբերակված արտահայտված տրանսկրիպտների և սպիտակուցների հարստացման վերլուծություն: Համընկնող արժեքները հարստացված են երկու տվյալների հավաքածուներում էլ, տրանսկրիպտոմի արժեքները հարստացված են միայն տրանսկրիպտոմում, իսկ պրոտեոմի արժեքները հարստացված են միայն պրոտեոմում: Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է clusterProfiler փաթեթի միջոցով՝ Բենջամինի-Հոխբերգի կողմից ճշգրտված p-արժեքներով: Ե. SCENIC-ի կողմից նույնականացված մանրաթելի տիպին բնորոշ տրանսկրիպցիոն գործոններ՝ հիմնվելով SCENIC-ից ստացված կարգավորիչի սպեցիֆիկության միավորների և մանրաթելերի տեսակների միջև mRNA-ի տարբերակված արտահայտման վրա։ Զ. Դանդաղ և արագ մանրաթելերի միջև տարբերակված արտահայտված ընտրված տրանսկրիպցիոն գործոնների պրոֆիլավորում։
Այնուհետև մենք կատարեցինք տարբեր ներկայացված գեների և սպիտակուցների գերներկայացվածության վերլուծություն (Նկար 4D, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 13): Երկու տվյալների հավաքածուների միջև տարբերվող հատկանիշների ուղիների հարստացումը բացահայտեց սպասվող տարբերություններ, ինչպիսիք են ճարպաթթուների β-օքսիդացումը և կետոնների նյութափոխանակության գործընթացները (դանդաղ մանրաթելեր), միոֆիլամենտի/մկանների կծկումը (համապատասխանաբար արագ և դանդաղ մանրաթելեր) և ածխաջրերի կատաբոլիկ գործընթացները (արագ մանրաթելեր): Սերին/թրեոնին սպիտակուցային ֆոսֆատազի ակտիվությունը նույնպես բարձրացել էր արագ մանրաթելերում, ինչը պայմանավորված էր կարգավորող և կատալիտիկ ֆոսֆատազային ենթամիավորների (PPP3CB, PPP1R3D և PPP1R3A) նման հատկանիշներով, որոնք հայտնի են գլիկոգենի նյութափոխանակությունը կարգավորող հատկանիշներով (47) (Լրացուցիչ նկարներ 8D–E): Արագ մանրաթելերով հարստացված այլ ուղիներից էին պրոտեոմում մշակող (P-) մարմինները (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (Լրացուցիչ նկ. 8F), որոնք հնարավոր է ներգրավված լինեն հետտրանսկրիպցիոն կարգավորման մեջ (48), և տրանսկրիպցիոն գործոնի ակտիվությունը (SREBF1, RXRG, RORA) տրանսկրիպտոմում (Լրացուցիչ նկ. 8G): Դանդաղ մանրաթելերը հարստացված էին օքսիդոռեդուկտազային ակտիվությամբ (BDH1, DCXR, TXN2) (Լրացուցիչ նկ. 8H), ամիդային կապով (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Լրացուցիչ նկ. 8I), արտաբջջային մատրիցով (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Լրացուցիչ նկ. 8J) և ընկալիչ-լիգանդ ակտիվությամբ (FNDC5, SPX, NENF) (Լրացուցիչ նկ. 8K):
Դանդաղ/արագ մկանային մանրաթելերի տիպի բնութագրերի հիմքում ընկած տրանսկրիպցիոն կարգավորման վերաբերյալ ավելի խորը պատկերացում կազմելու համար մենք իրականացրինք տրանսկրիպցիոն գործոնների հարստացման վերլուծություն՝ օգտագործելով SCENIC49 (Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 14): Արագ և դանդաղ մկանային մանրաթելերի միջև շատ տրանսկրիպցիոն գործոններ զգալիորեն հարստացված էին (Նկար 4E): Սա ներառում էր տրանսկրիպցիոն գործոններ, ինչպիսիք են MAFA-ն, որը նախկինում կապված է եղել մկանային մանրաթելերի արագ զարգացման հետ,50 ինչպես նաև մի քանի տրանսկրիպցիոն գործոններ, որոնք նախկինում կապված չէին մկանային մանրաթելերի տիպին հատուկ գեների ծրագրերի հետ: Դրանց թվում են PITX1-ը, EGR1-ը և MYF6-ը արագ մկանային մանրաթելերի ամենահարստացված տրանսկրիպցիոն գործոններն էին (Նկար 4E): Ի տարբերություն դրա, ZSCAN30-ը և EPAS1-ը (հայտնի է նաև որպես HIF2A) դանդաղ մկանային մանրաթելերի ամենահարստացված տրանսկրիպցիոն գործոններն էին (Նկար 4E): Համապատասխանաբար, MAFA-ն արտահայտվել է ավելի բարձր մակարդակներով UMAP շրջանում, որը համապատասխանում է արագ մկանային մանրաթելերին, մինչդեռ EPAS1-ն ուներ հակառակ արտահայտման օրինաչափությունը (Նկար 4F):
Բացի հայտնի սպիտակուց-կոդավորող գեներից, կան բազմաթիվ ոչ կոդավորող ՌՆԹ բիոտիպեր, որոնք կարող են ներգրավված լինել մարդու զարգացման և հիվանդությունների կարգավորման մեջ:51, 52 Տրանսկրիպտոմային տվյալների հավաքածուներում մի քանի ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ներ ցուցաբերում են մանրաթելի տեսակի յուրահատկություն (Նկար 5Ա և Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 15), այդ թվում՝ LINC01405-ը, որը խիստ յուրահատկ է դանդաղ մանրաթելերի համար և, ըստ հաղորդումների, նվազում է մկաններում միտոքոնդրիալ միոպաթիա ունեցող հիվանդների մոտ:53 Ի տարբերություն դրա, RP11-255P5.3-ը, որը համապատասխանում է lnc-ERCC5-5 գենին (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, ցուցաբերում է արագ մանրաթելի տեսակի յուրահատկություն: LINC01405-ը (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), և RP11-255P5.3-ը (https://tinyurl.com/29jmzder) ցուցաբերում են կմախքային մկանների յուրահատկություն (Լրացուցիչ նկարներ 9A–B) և չունեն հայտնի կծկվող գեներ իրենց 1 Մբ գենոմային հարևանությամբ, ինչը ենթադրում է, որ դրանք մասնագիտացված դեր են խաղում մանրաթելերի տեսակների կարգավորման մեջ, այլ ոչ թե հարևան կծկվող գեների կարգավորման մեջ: LINC01405-ի և RP11-255P5.3-ի դանդաղ/արագ մանրաթելերի տիպին բնորոշ արտահայտման պրոֆիլները, համապատասխանաբար, հաստատվել են RNAscope-ի միջոցով (Նկարներ 5B–C):
Ա. Ոչ կոդավորող ՌՆԹ տրանսկրիպտները զգալիորեն կարգավորվում են դանդաղ և արագ կծկվող մկանային մանրաթելերում: Բ. Ներկայացուցչական RNAscope պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս համապատասխանաբար LINC01405 և RP11-255P5.3 դանդաղ և արագ կծկվող մանրաթելերի տեսակի յուրահատկությունը: Սանդղակի սյուն = 50 մկմ: Գ. Միոֆիբրերի տիպին հատուկ ոչ կոդավորող ՌՆԹ արտահայտության քանակական որոշումը, ինչպես որոշվել է RNAscope-ի կողմից (n = 3 բիոպսիա անկախ անհատներից, համեմատելով արագ և դանդաղ մկանային մանրաթելերը յուրաքանչյուր անհատի ներսում): Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստի միջոցով: Տուփային գրաֆիկները ցույց են տալիս միջնարժեքը, առաջին և երրորդ քվարտիլները, որտեղ բեղիկները ցույց են տալիս նվազագույն և առավելագույն արժեքները: Դ. De novo մանրէային սպիտակուցի նույնականացման աշխատանքային հոսք (ստեղծվել է BioRender.com-ի միջոցով): Ե. LINC01405_ORF408:17441:17358 մանրէային սպիտակուցը հատուկ արտահայտվում է դանդաղ կմախքային մկանային մանրաթելերում (n = 5 բիոպսիա անկախ մասնակիցներից, համեմատելով արագ և դանդաղ մկանային մանրաթելերը յուրաքանչյուր մասնակցի մեջ): Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է Լիմմի գծային մոդելի մեթոդի և էմպիրիկ բայեսյան մոտեցման համադրությամբ, որին հաջորդել է Բենջամինի-Հոխբերգի մեթոդը՝ p-արժեքի ճշգրտմամբ բազմակի համեմատությունների համար: Տուփային գրաֆիկները ցույց են տալիս միջնարժեքը, առաջին և երրորդ քվարտիլները, որտեղ բեղիկները ցույց են տալիս առավելագույն/նվազագույն արժեքները:
Վերջերս ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ շատ ենթադրյալ ոչ կոդավորող տրանսկրիպտներ կոդավորում են տրանսկրիպցիայի ենթարկված մանրէային սպիտակուցներ, որոնցից մի քանիսը կարգավորում են մկանների գործառույթը։44, 55 Մանրաթելի տեսակի պոտենցիալ յուրահատկություն ունեցող մանրէային սպիտակուցները հայտնաբերելու համար մենք որոնել ենք մեր 1000 մանրաթելային պրոտեոմների տվյալների բազան՝ օգտագործելով FASTA ֆայլ, որը պարունակում է 1000 մանրաթելային տրանսկրիպտոմների տվյալների բազայում հայտնաբերված ոչ կոդավորող տրանսկրիպտների հաջորդականությունները (n = 305) (Նկար 5D): Մենք նույնականացրել ենք 197 մանրէային սպիտակուց 22 տարբեր տրանսկրիպտներից, որոնցից 71-ը տարբերակված կերպով կարգավորվում էին դանդաղ և արագ կմախքային մկանային մանրաթելերի միջև (Լրացուցիչ նկար 9C և Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 16): LINC01405-ի համար նույնականացվել են երեք մանրէային սպիտակուցային արգասիքներ, որոնցից մեկը ցույց է տվել դանդաղ մանրաթելերի յուրահատկություն, որը նման է իր տրանսկրիպտին (Նկար 5E և Լրացուցիչ նկար 9D): Այսպիսով, մենք նույնականացրել ենք LINC01405-ը որպես դանդաղ կմախքային մկանային մանրաթելերի համար յուրահատուկ մանրէային սպիտակուց կոդավորող գեն:
Մենք մշակել ենք առանձին մկանային մանրաթելերի լայնածավալ պրոտեոմիկ բնութագրման համապարփակ աշխատանքային հոսք և առողջ վիճակում հայտնաբերել ենք մանրաթելերի տարասեռության կարգավորիչներ: Մենք կիրառել ենք այս աշխատանքային հոսքը՝ հասկանալու համար, թե ինչպես են նեմալինային միոպաթիաները ազդում կմախքային մկանային մանրաթելերի տարասեռության վրա: Նեմալինային միոպաթիաները ժառանգական մկանային հիվանդություններ են, որոնք առաջացնում են մկանային թուլություն և, հիվանդ երեխաների մոտ, դրսևորվում են մի շարք բարդություններով, ներառյալ շնչառական անբավարարությունը, սկոլիոզը և վերջույթների սահմանափակ շարժունակությունը:19,20 Սովորաբար, նեմալինային միոպաթիաների դեպքում, ակտին ալֆա 1-ի (ACTA1) նման գեների պաթոգեն տարբերակները հանգեցնում են դանդաղ կծկվող մանրաթելային միոֆիբրերի կազմի գերակշռության, չնայած այս ազդեցությունը տարասեռ է: Մեկ նշանակալի բացառություն է տրոպոնին T1 նեմալինային միոպաթիան (TNNT1), որն ունի արագ մանրաթելերի գերակշռություն: Այսպիսով, նեմալինային միոպաթիաների դեպքում դիտվող կմախքային մկանային մանրաթելերի դիսռեգուլյացիայի հիմքում ընկած տարասեռության ավելի լավ ըմբռնումը կարող է օգնել բացահայտել այս հիվանդությունների և միոֆիբրերի տեսակի միջև բարդ կապը:
Առողջ վերահսկիչ խմբի համեմատ (n=3 մեկ խմբում), ACTA1 և TNNT1 գեների մուտացիաներով նեմալինային միոպաթիայով հիվանդներից մեկուսացված միոֆիբրերը ցույց տվեցին արտահայտված միոֆիբրերի ատրոֆիա կամ դիստրոֆիա (Նկար 6Ա, Լրացուցիչ աղյուսակ 3): Սա պրոտեոմիկ վերլուծության համար ներկայացրեց զգալի տեխնիկական մարտահրավերներ՝ առկա նյութի սահմանափակ քանակի պատճառով: Դրան չնայած, մենք կարողացանք հայտնաբերել 2485 սպիտակուց 272 կմախքային միոֆիբրերում: Յուրաքանչյուր մանրաթելի համար առնվազն 1000 քանակապես որոշված ​​սպիտակուց զտելուց հետո, 250 մանրաթել ենթարկվեց հետագա կենսաինֆորմատիկ վերլուծության: Զտելուց հետո, յուրաքանչյուր մանրաթելի համար միջինում քանակապես որոշվեց 1573 ± 359 սպիտակուց (Լրացուցիչ նկար 10Ա, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածուներ 17-18): Հատկանշական է, որ չնայած մանրաթելի չափի զգալի կրճատմանը, նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների նմուշների պրոտեոմի խորությունը միայն չնչին չափով նվազեց: Ավելին, այս տվյալների մշակումը մեր սեփական FASTA ֆայլերի միջոցով (ներառյալ ոչ կոդավորող տրանսկրիպտները) թույլ տվեց մեզ նույնականացնել հինգ մանրէային սպիտակուցներ նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների կմախքային միոֆիբրերում (Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 19): Պրոտեոմի դինամիկ տիրույթը զգալիորեն ավելի լայն էր, և վերահսկիչ խմբում ընդհանուր սպիտակուցները լավ համընկնում էին նախորդ 1000-մանրաթելային պրոտեոմի վերլուծության արդյունքների հետ (Լրացուցիչ նկ. 10B–C):
Ա. Մանրադիտակային պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս մանրաթելերի ատրոֆիա կամ դիստրոֆիա և տարբեր տեսակի մանրաթելերի գերակշռություն՝ հիմնված MYH-ի վրա ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաների (NM) դեպքում: Սանդղակի գիծ = 100 մկմ: ACTA1 և TNNT1 հիվանդների մոտ ներկման վերարտադրելիությունն ապահովելու համար, երեք հիվանդների բիոպսիաներ ներկվել են երկու-երեք անգամ (յուրաքանչյուր դեպքում չորս հատված)՝ նախքան ներկայացուցչական պատկերների ընտրությունը: Բ. Մասնակիցների մոտ մանրաթելերի տեսակի համամասնությունները՝ հիմնված MYH-ի վրա: Գ. Նեմալինային միոպաթիաներով հիվանդների և վերահսկիչ խմբի կմախքային մկանային մանրաթելերի գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) գրաֆիկ: Դ. Նեմալինային միոպաթիաներով և վերահսկիչ խմբի հիվանդների կմախքային մկանային մանրաթելերը պրոյեկտվել են PCA գրաֆիկի վրա, որը որոշվել է նկար 2-ում վերլուծված 1000 մանրաթելերից: Օրինակ՝ հրաբխային գրաֆիկներ, որոնք համեմատում են ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաներով մասնակիցների և վերահսկիչ խմբի, ինչպես նաև ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաներով մասնակիցների միջև եղած տարբերությունները: Գունավոր շրջանակները նշանակում են սպիտակուցներ, որոնք զգալիորեն տարբերվում էին π < 0.05 դեպքում, իսկ մուգ կետերը՝ սպիտակուցներ, որոնք զգալիորեն տարբերվում էին FDR < 0.05 դեպքում: Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է Լիմմայի գծային մոդելի մեթոդով և էմպիրիկ բայեսյան մեթոդներով, որին հաջորդել է p-արժեքի ճշգրտումը՝ բազմակի համեմատությունների համար՝ օգտագործելով Բենջամինի-Հոխբերգի մեթոդը: Ը. Ամբողջ պրոտեոմում և 1-ին և 2A տիպի մանրաթելերում զգալիորեն տարբեր արտահայտված սպիտակուցների հարստացման վերլուծություն: Վիճակագրական վերլուծությունը կատարվել է clusterProfiler փաթեթի և Բենջամինի-Հոխբերգի ճշգրտված p-արժեքների միջոցով: I, J. Գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) գրաֆիկներ, որոնք գունավորվել են արտաբջջային մատրիցի և միտոքոնդրիալ գեների օնտոլոգիայի (GO) տերմիններով:
Քանի որ նեմալինային միոպաթիաները կարող են ազդել կմախքային մկաններում MYH-արտահայտող միոֆիբրերի տեսակների համամասնության վրա,19,20 մենք նախ ուսումնասիրեցինք MYH-արտահայտող միոֆիբրերի տեսակները նեմալինային միոպաթիաներով հիվանդների և վերահսկիչ խմբի մոտ: Մենք որոշեցինք միոֆիբրերի տեսակը՝ օգտագործելով 1000 միոֆիբրերի վերլուծության համար նախկինում նկարագրված անաչառ մեթոդը (Լրացուցիչ նկ. 10D-E) և կրկին չկարողացանք նույնականացնել մաքուր 2X միոֆիբրեր (Նկար 6B): Մենք դիտարկեցինք նեմալինային միոպաթիաների տարասեռ ազդեցությունը միոֆիբրերի տեսակի վրա, քանի որ ACTA1 մուտացիաներով երկու հիվանդների մոտ 1-ին տիպի միոֆիբրերի համամասնությունը բարձրացել էր, մինչդեռ TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով երկու հիվանդների մոտ 1-ին տիպի միոֆիբրերի համամասնությունը նվազել էր (Նկար 6B): Իրոք, MYH2-ի և արագ տրոպոնինի իզոֆորմների (TNNC2, TNNI2 և TNNT3) արտահայտությունը նվազել է ACTA1-նեմալինային միոպաթիաների դեպքում, մինչդեռ MYH7 արտահայտությունը նվազել է TNNT1-նեմալինային միոպաթիաների դեպքում (Լրացուցիչ նկար 11A): Սա համապատասխանում է նեմալինային միոպաթիաների դեպքում միոֆիբրերի տարասեռ տիպի փոփոխությունների վերաբերյալ նախկինում հրապարակված հաղորդագրությունների հետ։19,20 Մենք հաստատեցինք այս արդյունքները իմունահյուսվածքաքիմիական միջոցով և պարզեցինք, որ ACTA1-նեմալինային միոպաթիա ունեցող հիվանդների մոտ գերակշռում էին 1-ին տիպի միոֆիբրերը, մինչդեռ TNNT1-նեմալինային միոպաթիա ունեցող հիվանդների մոտ հակառակ պատկերն էր (Նկար 6A):
Միաթելային պրոտեոմի մակարդակում, ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների կմախքային մկանային մանրաթելերը խմբավորվել են վերահսկիչ մանրաթելերի մեծամասնության հետ, որտեղ TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների կմախքային մկանային մանրաթելերը, որպես կանոն, ամենաշատն են տուժել (Նկար 6C): Սա հատկապես ակնհայտ էր յուրաքանչյուր հիվանդի համար կեղծ-փքված մանրաթելերի գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) գրաֆիկները կազմելիս, որտեղ TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների 2-րդ և 3-րդ խմբերը ամենահեռու էին վերահսկիչ նմուշներից (Լրացուցիչ նկար 11B, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 20): Որպեսզի ավելի լավ հասկանանք, թե ինչպես են միոպաթիայով հիվանդների մանրաթելերը համեմատվում առողջ մանրաթելերի հետ, մենք օգտագործել ենք առողջ չափահաս մասնակիցների 1000 մանրաթելերի պրոտեոմիկ վերլուծությունից ստացված մանրամասն տեղեկատվություն: Մենք միոպաթիայի տվյալների հավաքածուից (ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդներ և վերահսկիչ խումբ) մանրաթելեր ենք կանխատեսել 1000 մանրաթելերից պրոտեոմիկ վերլուծությունից ստացված PCA գրաֆիկի վրա (Նկար 6D): MYH մանրաթելերի տեսակների բաշխումը PC2-ի երկայնքով վերահսկիչ մանրաթելերում նման էր 1000 մանրաթելից բաղկացած պրոտեոմիկ վերլուծությունից ստացված մանրաթելերի բաշխմանը: Այնուամենայնիվ, նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների մոտ մանրաթելերի մեծ մասը տեղաշարժվել է PC2-ի ուղղությամբ դեպի ներքև՝ համընկնելով առողջ արագ կծկվող մանրաթելերի հետ՝ անկախ նրանց բնիկ MYH մանրաթելի տեսակից: Այսպիսով, չնայած ACTA1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների մոտ MYH-ի վրա հիմնված մեթոդներով քանակական որոշման ժամանակ ցույց է տրվել տեղաշարժ դեպի 1-ին տիպի մանրաթելեր, և՛ ACTA1 նեմալինային միոպաթիան, և՛ TNNT1 նեմալինային միոպաթիան տեղաշարժել են կմախքային մկանային մանրաթելերի պրոտեոմը դեպի արագ կծկվող մանրաթելեր:
Այնուհետև մենք յուրաքանչյուր հիվանդների խումբը ուղղակիորեն համեմատեցինք առողջ վերահսկիչ խմբի հետ և համապատասխանաբար նույնականացրինք 256 և 552 տարբերակված արտահայտված սպիտակուցներ ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաներում (Նկար 6E–G և լրացուցիչ նկար 11C, լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 21): Գեների հարստացման վերլուծությունը բացահայտեց միտոքոնդրիալ սպիտակուցների համակարգված նվազում (Նկար 6H–I, լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 22): Հետաքրքիր է, որ չնայած ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաներում մանրաթելերի տեսակների տարբերակված գերակշռությանը, այս նվազումը լիովին անկախ էր MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելի տեսակից (Նկար 6H և լրացուցիչ նկարներ 11D–I, լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 23): Երեք մանրէային սպիտակուցներ նույնպես կարգավորվեցին ACTA1 կամ TNNT1 նեմալինային միոպաթիաներում: Այս միկրոպրոտեիններից երկուսը՝ ENSG00000215483_TR14_ORF67-ը (հայտնի է նաև որպես LINC00598 կամ Lnc-FOXO1) և ENSG00000229425_TR25_ORF40-ը (lnc-NRIP1-2), տարբեր առատություն են ցուցաբերել միայն 1-ին տիպի միոթելերում: Նախկինում հաղորդվել է, որ ENSG00000215483_TR14_ORF67-ը դեր է խաղում բջջային ցիկլի կարգավորման մեջ:56 Մյուս կողմից, ENSG00000232046_TR1_ORF437-ը (համապատասխանում է LINC01798-ին) ավելացել է ինչպես 1-ին, այնպես էլ 2A տիպի միոթելերում ACTA1-նեմալինային միոպաթիայի դեպքում՝ առողջ վերահսկող խմբի համեմատ (Լրացուցիչ նկար 12Ա, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 24): Ի տարբերություն դրա, ռիբոսոմային սպիտակուցները մեծապես չեն ազդվել նեմալինային միոպաթիայի կողմից, չնայած RPS17-ը նվազել է ACTA1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում (Նկար 6E):
Հարստացման վերլուծությունը նաև բացահայտեց իմունային համակարգի գործընթացների ակտիվացումը ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաների դեպքում, մինչդեռ բջջային ադհեզիան նույնպես մեծացել էր TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում (Նկար 6H): Այս արտաբջջային գործոնների հարստացումը արտացոլվում էր արտաբջջային մատրիցի սպիտակուցների կողմից PC1-ում և PC2-ում PCA-ն բացասական ուղղությամբ տեղաշարժելով (այսինքն՝ դեպի ամենաշատ տուժած մանրաթելերը) (Նկար 6J): Հիվանդների երկու խմբերն էլ ցույց տվեցին իմունային պատասխաններում և սարկոլեմայի վերականգնման մեխանիզմներում ներգրավված արտաբջջային սպիտակուցների, ինչպիսիք են անեքսինները (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 և դրանց փոխազդեցիկ սպիտակուց S100A1159-ը (Լրացուցիչ նկարներ 12B–C): Այս գործընթացը նախկինում հաղորդվել է մկանային դիստրոֆիաների դեպքում ուժեղանալու մասին60, բայց, մեր իմացության չափով, նախկինում չի կապված եղել նեմալինային միոպաթիաների հետ: Այս մոլեկուլային մեխանիզմի նորմալ գործառույթը անհրաժեշտ է վնասվածքից հետո սարկոլեմայի վերականգնման և նոր ձևավորված միոցիտների միաթելերի հետ միաձուլման համար58,61: Այսպիսով, այս գործընթացի ակտիվության աճը երկու հիվանդների խմբերում էլ ենթադրում է միոֆիբրերի անկայունության հետևանքով առաջացած վնասվածքի վերականգնողական արձագանք։
Յուրաքանչյուր նեմալինային միոպաթիայի ազդեցությունը լավ համընկնում էր (r = 0.736) և ցույց էր տալիս բավականին համընկնում (Լրացուցիչ նկարներ 11A–B), ինչը ցույց է տալիս, որ ACTA1-ը և TNNT1 նեմալինային միոպաթիան նմանատիպ ազդեցություն ունեն պրոտեոմի վրա: Այնուամենայնիվ, որոշ սպիտակուցներ կարգավորվում էին միայն ACTA1 կամ TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում (Լրացուցիչ նկարներ 11A և C): Պրոֆիբրոտիկ սպիտակուց MFAP4-ը TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի ամենաշատ ակտիվացված սպիտակուցներից մեկն էր, բայց մնաց անփոփոխ ACTA1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում: SKIC8-ը, որը PAF1C համալիրի բաղադրիչ է, որը պատասխանատու է HOX գենի տրանսկրիպցիայի կարգավորման համար, իջեցված էր TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում, բայց չէր ազդվում ACTA1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում (Լրացուցիչ նկար 11A): ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի ուղղակի համեմատությունը ցույց տվեց միտոքոնդրիալ սպիտակուցների ավելի մեծ նվազում և իմունային համակարգի սպիտակուցների աճ TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում (Նկար 6G–H և լրացուցիչ նկարներ 11C և 11H–I): Այս տվյալները համապատասխանում են TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի և TNNT1 նեմալինային միոպաթիայի դեպքում (Նկար 6A) դիտարկվող ավելի մեծ ատրոֆիայի/դիստրոֆիայի հետ, ինչը ենթադրում է, որ TNNT1 նեմալինային միոպաթիան ներկայացնում է հիվանդության ավելի ծանր ձև:
Գնահատելու համար, թե արդյոք նեմալինային միոպաթիայի դիտարկված ազդեցությունները շարունակվում են ամբողջ մկանային մակարդակում, մենք կատարեցինք TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների նույն խմբի մկանային բիոպսիաների զանգվածային պրոտեոմիկ վերլուծություն և համեմատեցինք դրանք վերահսկիչ խմբի հետ (n=3 մեկ խմբում) (Լրացուցիչ նկ. 13Ա, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 25): Ինչպես և սպասվում էր, վերահսկիչ խումբը սերտորեն կապված էր հիմնական բաղադրիչների վերլուծության մեջ, մինչդեռ TNNT1 նեմալինային միոպաթիայով հիվանդները ցուցաբերեցին ավելի բարձր միջնորմային փոփոխականություն, նման մեկ մանրաթելի վերլուծության մեջ դիտվածին (Լրացուցիչ նկ. 13Բ): Զանգվածային վերլուծությունը վերարտադրեց տարբերակված արտահայտված սպիտակուցները (Լրացուցիչ նկ. 13Գ, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 26) և կենսաբանական գործընթացները (Լրացուցիչ նկ. 13Դ, Լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 27), որոնք ընդգծվեցին առանձին մանրաթելերի համեմատությամբ, բայց կորցրեց տարբեր մանրաթելերի տեսակները տարբերակելու ունակությունը և չկարողացավ հաշվի առնել մանրաթելերի միջև հիվանդության տարասեռ ազդեցությունները:
Ամփոփելով՝ այս տվյալները ցույց են տալիս, որ միաֆիբրային պրոտեոմիկան կարող է պարզաբանել կլինիկական կենսաբանական առանձնահատկությունները, որոնք չեն հայտնաբերվել թիրախային մեթոդներով, ինչպիսին է իմունոբլոտինգը: Ավելին, այս տվյալները ընդգծում են միայն ակտինային մանրաթելերի տիպավորման (MYH) օգտագործման սահմանափակումները՝ ֆենոտիպային ադապտացիան նկարագրելու համար: Իրոք, չնայած մանրաթելերի տեսակի փոխարկումը տարբերվում է ակտինային և տրոպոնինային նեմալինային միոպաթիաների միջև, երկու նեմալինային միոպաթիաներն էլ MYH մանրաթելերի տիպավորումը անջատում են կմախքային մկանային մանրաթելերի նյութափոխանակությունից՝ դեպի ավելի արագ և պակաս օքսիդատիվ մկանային պրոտեոմ:
Բջջային անհամասեռությունը կարևոր է հյուսվածքների համար՝ իրենց բազմազան պահանջները բավարարելու համար: Կմախքային մկաններում սա հաճախ նկարագրվում է որպես մանրաթելերի տեսակներ, որոնք բնութագրվում են ուժի արտադրության և հոգնածության տարբեր աստիճաններով: Այնուամենայնիվ, պարզ է, որ սա բացատրում է կմախքային մկանային մանրաթելերի փոփոխականության միայն մի փոքր մասը, որը շատ ավելի փոփոխական, բարդ և բազմակողմանի է, քան նախկինում կարծում էին: Տեխնոլոգիական առաջընթացն այժմ լույս է սփռել կմախքային մկանային մանրաթելերը կարգավորող գործոնների վրա: Իրոք, մեր տվյալները ենթադրում են, որ 2X տիպի մանրաթելերը կարող են չլինել կմախքային մկանային մանրաթելերի առանձին ենթատեսակ: Ավելին, մենք նույնականացրել ենք նյութափոխանակության սպիտակուցները, ռիբոսոմային սպիտակուցները և բջիջներին առնչվող սպիտակուցները որպես կմախքային մկանային մանրաթելերի անհամասեռության հիմնական որոշիչներ: Մեր պրոտեոմիկ աշխատանքային հոսքը կիրառելով նեմատոդային միոպաթիայով հիվանդների նմուշների վրա, մենք նաև ցույց տվեցինք, որ MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելերի տիպավորումը լիովին չի արտացոլում կմախքային մկանների անհամասեռությունը, հատկապես, երբ համակարգը խախտված է: Իրոք, անկախ MYH-ի վրա հիմնված մանրաթելերի տեսակից, նեմատոդային միոպաթիան հանգեցնում է ավելի արագ և պակաս օքսիդատիվ մանրաթելերի տեղաշարժի:
Կմախքային մկանային մանրաթելերը դասակարգվել են 19-րդ դարից ի վեր: Վերջին օմիկական վերլուծությունները թույլ են տվել մեզ սկսել հասկանալ տարբեր MYH մանրաթելերի արտահայտման պրոֆիլները և դրանց արձագանքը տարբեր խթաններին: Ինչպես նկարագրված է այստեղ, օմիկական մոտեցումները նաև առավելություն ունեն մանրաթելային տիպի մարկերների քանակականացման համար ավելի մեծ զգայունության, քան ավանդական հակամարմինների վրա հիմնված մեթոդները, առանց հենվելու կմախքային մկանային մանրաթելի տեսակը սահմանելու համար մեկ (կամ մի քանի) մարկերների քանակականացման վրա: Մենք օգտագործել ենք լրացուցիչ տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ աշխատանքային հոսքեր և ինտեգրել արդյունքները՝ մարդու կմախքային մկանային մանրաթելերում մանրաթելերի տարասեռության տրանսկրիպցիոն և հետտրանսկրիպցիոն կարգավորումը ուսումնասիրելու համար: Այս աշխատանքային հոսքը հանգեցրել է մեր առողջ երիտասարդ տղամարդկանց խմբի սպիտակուցային մակարդակում մաքուր 2X տիպի մանրաթելերի նույնականացման անհաջողությանը: Սա համապատասխանում է նախորդ մեկ մանրաթելի ուսումնասիրություններին, որոնք առողջ vastus lateralis-ում հայտնաբերել են <1% մաքուր 2X մանրաթելեր, չնայած դա պետք է հաստատվի այլ մկաններում ապագայում: mRNA մակարդակում գրեթե մաքուր 2X մանրաթելերի հայտնաբերման և սպիտակուցային մակարդակում միայն խառը 2A/2X մանրաթելերի հայտնաբերման միջև անհամապատասխանությունը զարմանալի է: MYH իզոֆորմ mRNA-ի արտահայտությունը ցիրկադային չէ,67 ինչը ենթադրում է, որ մենք քիչ հավանական է, որ «բաց թողնենք» MYH2-ի սկզբնական ազդանշանը թվացյալ մաքուր 2X մանրաթելերում՝ RNA մակարդակում: Հնարավոր բացատրություններից մեկը, թեև զուտ հիպոթետիկ, կարող է լինել MYH իզոֆորմների միջև սպիտակուցի և/կամ mRNA կայունության տարբերությունները: Իրոք, ոչ մի արագ մանրաթել 100% մաքուր չէ որևէ MYH իզոֆորմի համար, և պարզ չէ, թե արդյոք MYH1 mRNA-ի 70-90% արտահայտման մակարդակները կհանգեցնեն MYH1-ի և MYH2-ի հավասար առատության սպիտակուցային մակարդակում: Այնուամենայնիվ, ամբողջ տրանսկրիպտոմը կամ պրոտեոմը դիտարկելիս, կլաստերային վերլուծությունը կարող է վստահորեն նույնականացնել միայն երկու տարբեր կլաստերներ, որոնք ներկայացնում են դանդաղ և արագ կմախքային մկանային մանրաթելեր՝ անկախ դրանց ճշգրիտ MYH կազմից: Սա համապատասխանում է միամիջուկային տրանսկրիպտոմիկ մոտեցումներ օգտագործող վերլուծություններին, որոնք սովորաբար նույնականացնում են միայն երկու տարբեր միոնուկլեար կլաստերներ: 68, 69, 70 Ավելին, չնայած նախորդ պրոտեոմիկ ուսումնասիրությունները բացահայտել են 2X տիպի մանրաթելեր, այս մանրաթելերը չեն խմբավորվում մնացած արագ մանրաթելերից առանձին և ցուցաբերում են միայն փոքր քանակությամբ տարբեր առատ սպիտակուցներ՝ համեմատած MYH-ի վրա հիմնված այլ մանրաթելերի տեսակների հետ։14 Այս արդյունքները ենթադրում են, որ մենք պետք է վերադառնանք 20-րդ դարի սկզբի մկանային մանրաթելերի դասակարգման տեսակետին, որը մարդու կմախքային մկանային մանրաթելերը բաժանում էր ոչ թե MYH-ի վրա հիմնված երեք տարբեր դասերի, այլ երկու կլաստերների՝ հիմնվելով դրանց նյութափոխանակության և կծկման հատկությունների վրա։63
Ավելի կարևոր է, որ միոֆիբրերի տարասեռությունը պետք է դիտարկել բազմաթիվ չափումներով։ Նախորդ «օմիկայի» ուսումնասիրությունները ցույց են տվել այս ուղղությունը՝ ենթադրելով, որ կմախքային մկանային մանրաթելերը չեն կազմում առանձին կլաստերներ, այլ դասավորված են շարունակականության երկայնքով։11, 13, 14, 64, 71 Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ կմախքային մկանների կծկման և նյութափոխանակության հատկությունների տարբերություններից բացի, միոֆիբրերը կարող են տարբերակվել բջիջ-բջիջ փոխազդեցությունների և թարգմանության մեխանիզմների հետ կապված առանձնահատկություններով։ Իրոք, մենք հայտնաբերեցինք ռիբոսոմների տարասեռություն կմախքային մկանային մանրաթելերում, որը նպաստում է տարասեռությանը անկախ դանդաղ և արագ մանրաթելերի տեսակներից։ Այս էական միոֆիբրերի տարասեռության հիմքում ընկած պատճառը, անկախ դանդաղ և արագ մանրաթելերի տեսակից, մնում է անհասկանալի, բայց այն կարող է վկայել մկանային փնջերի ներսում մասնագիտացված տարածական կազմակերպման մասին, որոնք օպտիմալ կերպով արձագանքում են որոշակի ուժերին և բեռներին,72 մկանային միկրոմիջավայրում այլ բջջային տեսակների հետ մասնագիտացված բջջային կամ օրգան-հատուկ հաղորդակցության73,74,75 կամ առանձին միոֆիբրերի ներսում ռիբոսոմների ակտիվության տարբերությունների մասին։ Իրոք, ռիբոսոմային հետերոպլազմիան, կա՛մ RPL3-ի և RPL3L-ի պարալոգային փոխարինման միջոցով, կա՛մ rRNA-ի 2′O-մեթիլացման մակարդակով, կապված է կմախքային մկանների հիպերտրոֆիայի հետ76,77: Բազմաօմիկ և տարածական կիրառությունները, զուգորդված առանձին միոթելերի ֆունկցիոնալ բնութագրման հետ, կխորացնեն մկանների կենսաբանության մեր ըմբռնումը բազմաօմիկ մակարդակում78:
Վերլուծելով նեմալինային միոպաթիաներով հիվանդների առանձին միոֆիբրերի պրոտեոմները, մենք նաև ցույց տվեցինք առանձին միոֆիբրերի պրոտեոմիկայի օգտակարությունը, արդյունավետությունը և կիրառելիությունը կմախքային մկանների կլինիկական պաթոֆիզիոլոգիան պարզաբանելու համար: Ավելին, մեր աշխատանքային հոսքը համեմատելով գլոբալ պրոտեոմիկ վերլուծության հետ, մենք կարողացանք ցույց տալ, որ առանձին միոֆիբրերի պրոտեոմիկան տալիս է նույն խորությունը տեղեկատվության, ինչ գլոբալ հյուսվածքային պրոտեոմիկան, և ընդլայնում է այս խորությունը՝ հաշվի առնելով միջմանրաթելային տարասեռությունը և միոֆիբրերի տեսակը: Բացի ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաների դեպքում առողջ վերահսկիչ խմբի համեմատ դիտարկված մանրաթելերի տեսակի հարաբերակցության սպասվող (թեև փոփոխական) տարբերություններից,19 մենք նաև դիտարկեցինք օքսիդատիվ և արտաբջջային վերակառուցում՝ անկախ MYH-միջնորդավորված մանրաթելերի տեսակի փոխարկումից: TNNT1 նեմալինային միոպաթիաների դեպքում նախկինում հայտնաբերվել է ֆիբրոզ։19 Այնուամենայնիվ, մեր վերլուծությունը հիմնված է այս հայտնագործության վրա՝ նաև բացահայտելով ACTA1 և TNNT1 նեմալինային միոպաթիաներով հիվանդների միոֆիբրերում սարկոլեմայի վերականգնման մեխանիզմներում ներգրավված արտաբջջային արտազատվող սթրեսի հետ կապված սպիտակուցների, ինչպիսիք են անեքսինները, մակարդակի բարձրացում։57,58,59 Եզրափակելով՝ նեմալինային միոպաթիայով հիվանդների միոֆիբրներում անեքսինի մակարդակի բարձրացումը կարող է ներկայացնել բջջային պատասխան՝ ծանր ատրոֆիկ միոֆիբրները վերականգնելու համար։
Չնայած այս ուսումնասիրությունը ներկայացնում է մինչ օրս մարդկանց վրա կատարված ամենամեծ մեկ մանրաթելի ամբողջական մկանների օմիկայի վերլուծությունը, այն զերծ չէ սահմանափակումներից: Մենք մեկուսացրել ենք կմախքային մկանային մանրաթելերը մասնակիցների համեմատաբար փոքր և միատարր նմուշից և մեկ մկանից (vastus lateralis): Հետևաբար, անհնար է բացառել մկանային տեսակների և մկանային ֆիզիոլոգիայի ծայրահեղ դեպքերում հատուկ մանրաթելային պոպուլյացիաների գոյությունը: Օրինակ, մենք չենք կարող բացառել գերարագ մանրաթելերի ենթաբազմության (օրինակ՝ մաքուր 2X մանրաթելեր) առաջացման հնարավորությունը բարձր մարզված վազորդների և/կամ ուժային մարզիկների79 կամ մկանային անգործության ժամանակահատվածներում66,80: Ավելին, մասնակիցների սահմանափակ նմուշի չափը մեզ թույլ չտվեց հետազոտել մանրաթելերի տարասեռության մեջ սեռային տարբերությունները, քանի որ հայտնի է, որ մանրաթելերի տեսակների հարաբերակցությունները տարբերվում են տղամարդկանց և կանանց մոտ: Ավելին, մենք չկարողացանք անցկացնել տրանսկրիպտոմիկ և պրոտեոմիկ վերլուծություններ նույն մկանային մանրաթելերի կամ նույն մասնակիցների նմուշների վրա: Քանի որ մենք և ուրիշները շարունակում ենք օպտիմալացնել միաբջիջ և միամիոֆիբր վերլուծությունները՝ օգտագործելով օմիկական վերլուծություն՝ գերցածր նմուշային մուտքի հասնելու համար (ինչպես ցույց է տրված այստեղ միտոքոնդրիալ միոպաթիա ունեցող հիվանդների մանրաթելերի վերլուծության մեջ), ակնհայտ է դառնում բազմամիկային (և ֆունկցիոնալ) մոտեցումները մեկ մկանային մանրաթելերի շրջանակներում համատեղելու հնարավորությունը։
Ընդհանուր առմամբ, մեր տվյալները բացահայտում և բացատրում են կմախքային մկանների տարասեռության տրանսկրիպցիոն և հետտրանսկրիպցիոն շարժիչ ուժերը: Մասնավորապես, մենք ներկայացնում ենք տվյալներ, որոնք մարտահրավեր են նետում կմախքային մկանների ֆիզիոլոգիայի մեջ մանրաթելերի տեսակների դասական MYH-ի վրա հիմնված սահմանման հետ կապված վաղուց գոյություն ունեցող դոգմային: Մենք հույս ունենք վերսկսել բանավեճը և, ի վերջո, վերանայել կմախքային մկանային մանրաթելերի դասակարգման և տարասեռության մեր ըմբռնումը:
Տասնչորս կովկասյան մասնակիցներ (12 տղամարդ և 2 կին) կամավոր համաձայնվեցին մասնակցել այս ուսումնասիրությանը: Ուսումնասիրությունը հաստատվել է Գենտի համալսարանական հիվանդանոցի (BC-10237) էթիկայի կոմիտեի կողմից, համապատասխանել է 2013 թվականի Հելսինկյան հռչակագրին և գրանցվել է ClinicalTrials.gov կայքում (NCT05131555): Մասնակիցների ընդհանուր բնութագրերը ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 1-ում: Բանավոր և գրավոր տեղեկացված համաձայնություն ստանալուց հետո մասնակիցները ենթարկվել են բժշկական զննման՝ ուսումնասիրությանը վերջնական ընդգրկվելուց առաջ: Մասնակիցները երիտասարդ էին (22-42 տարեկան), առողջ (առանց առողջական խնդիրների, առանց ծխելու պատմության) և չափավոր ֆիզիկապես ակտիվ: Թթվածնի առավելագույն կլանումը որոշվել է ֆիզիկական պատրաստվածությունը գնահատելու համար աստիճանային էրգոմետրի միջոցով, ինչպես նկարագրվել է նախկինում: 81
Մկանային բիոպսիայի նմուշները հավաքվել են հանգստի և քաղցած վիճակում երեք անգամ՝ 14 օրվա ընդմիջումով: Քանի որ այս նմուշները հավաքվել են ավելի լայն ուսումնասիրության շրջանակներում, մասնակիցները բիոպսիայից 40 րոպե առաջ օգտագործել են պլացեբո (լակտոզա), H1-ընկալիչների անտագոնիստ (540 մգ ֆեքսոֆենադին) կամ H2-ընկալիչների անտագոնիստ (40 մգ ֆամոտիդին): Մենք նախկինում ցույց ենք տվել, որ այս հիստամինային ընկալիչների անտագոնիստները չեն ազդում հանգստի վիճակում գտնվող կմախքային մկանների ֆիզիկական պատրաստվածության վրա81, և մեր որակի վերահսկման գրաֆիկներում (Լրացուցիչ նկարներ 3 և 6) վիճակի հետ կապված կլաստերացում չի նկատվել: Յուրաքանչյուր փորձարարական օրվանից 48 ժամ առաջ պահպանվել է ստանդարտացված սննդակարգ (41.4 կկալ/կգ մարմնի քաշ, 5.1 գ/կգ մարմնի քաշի ածխաջրեր, 1.4 գ/կգ մարմնի քաշի սպիտակուցներ և 1.6 գ/կգ մարմնի քաշի ճարպեր), և փորձարարական օրվա առավոտյան ընդունվել է ստանդարտացված նախաճաշ (1.5 գ/կգ մարմնի քաշի ածխաջրեր): Տեղային անզգայացման տակ (0.5 մլ 1% լիդոկաին առանց էպինեֆրինի), մկանային բիոպսիաներ են վերցվել vastus lateralis մկանից՝ օգտագործելով պերկուտան Բերգստրյոմի ասպիրացիա։82 Մկանային նմուշները անմիջապես տեղադրվել են RNAlater-ի մեջ և պահվել 4°C ջերմաստիճանում մինչև մանրաթելերի ձեռքով դիսեկցիան (մինչև 3 օր):
Թարմ մեկուսացված միոֆիբրերի խրձերը տեղափոխվել են մշակութային ամանի մեջ գտնվող թարմ RNA later միջավայր: Այնուհետև առանձին միոֆիբրերը ձեռքով դիսեկցվել են ստերեոմիկրոսկոպի և նուրբ աքցանի միջոցով: Յուրաքանչյուր բիոպսիայից դիսեկցվել է քսանհինգ մանրաթել՝ հատուկ ուշադրություն դարձնելով բիոպսիայի տարբեր հատվածներից մանրաթելերի ընտրությանը: Դիեկցիայի ավարտից հետո յուրաքանչյուր մանրաթել զգուշորեն ընկղմվել է 3 մկլ լիզիսի բուֆերի մեջ (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), որը պարունակում է պրոտեինազ K և DNase ֆերմենտներ՝ անցանկալի սպիտակուցներն ու ԴՆԹ-ն հեռացնելու համար: Բջջային լիզիսը և սպիտակուցի/ԴՆԹ-ի հեռացումը սկսվել են կարճատև պտտեցմամբ, հեղուկը միկրոցենտրիֆուգում պտտեցնելով և սենյակային ջերմաստիճանում ինկուբացիայով (10 րոպե): Այնուհետև լիզատը ինկուբացվել է ջերմային ցիկլերի սարքում (T100, Bio-Rad) 37°C-ում 5 րոպե, 75°C-ում՝ 5 րոպե, ապա անմիջապես պահվել է -80°C-ում մինչև հետագա մշակումը:
Illumina-ի հետ համատեղելի պոլիադենիլացված ՌՆԹ գրադարանները պատրաստվել են 2 մկլ միոֆիբեր լիզատից՝ օգտագործելով QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq գրադարանի նախապատրաստման հավաքածուն (Lexogen): Մանրամասն մեթոդները կարելի է գտնել արտադրողի ձեռնարկում: Գործընթացը սկսվում է առաջին շղթայի կԴՆԹ-ի սինթեզով՝ հակադարձ տրանսկրիպցիայի միջոցով, որի ընթացքում ներմուծվում են եզակի մոլեկուլային նույնականացուցիչներ (UMI) և նմուշին հատուկ i1 շտրիխ կոդեր՝ նմուշների համախմբումն ապահովելու և հետագա մշակման ընթացքում տեխնիկական փոփոխականությունը նվազեցնելու համար: Այնուհետև 96 միոֆիբերի կԴՆԹ-ն համախմբվում և մաքրվում է մագնիսական գնդիկներով, որից հետո ՌՆԹ-ն հեռացվում է, և երկրորդ շղթայի սինթեզը կատարվում է պատահական պրայմերների միջոցով: Գրադարանը մաքրվում է մագնիսական գնդիկներով, ավելացվում են խմբին հատուկ i5/i7 պիտակներ, և ուժեղացվում է ՊՇՌ-ը: Վերջնական մաքրման քայլը ստեղծում է Illumina-ի հետ համատեղելի գրադարաններ: Յուրաքանչյուր գրադարանի հավաքածուի որակը գնահատվել է բարձր զգայունության փոքր ֆրագմենտային ԴՆԹ վերլուծության հավաքածուի միջոցով (Agilent Technologies, DNF-477-0500):
Քուբիթների քանակականացման հիման վրա, խմբերը հետագայում միավորվեցին էկվիմոլյար կոնցենտրացիաներով (2 նՄ): Արդյունքում ստացված խումբը հաջորդականացվեց NovaSeq 6000 սարքի վրա ստանդարտ ռեժիմով՝ օգտագործելով NovaSeq S2 Reagent Kit-ը (1 × 100 նուկլեոտիդ)՝ 2 նՄ բեռնվածությամբ (4% PhiX):
Մեր խողովակաշարը հիմնված է Lexogen-ի QuantSeq Pool տվյալների վերլուծության խողովակաշարի վրա (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis): Տվյալները նախ դեմուլտիպլեքսավորվել են bcl2fastq2-ով (v2.20.0)՝ i7/i5 ինդեքսի հիման վրա: Այնուհետև ընթերցված 2-ը դեմուլտիպլեքսավորվել է idemux-ով (v0.1.6)՝ i1 նմուշի շտրիխ կոդի հիման վրա, և UMI հաջորդականությունները արդյունահանվել են umi_tools-ով (v1.0.1): Այնուհետև ընթերցումները կտրվել են cutadapt-ով (v3.4)՝ մի քանի փուլով՝ կարճ ընթերցումները (<20 երկարությամբ) կամ միայն ադապտեր հաջորդականություններից բաղկացած ընթերցումները հեռացնելու համար: Այնուհետև ընթերցումները համապատասխանեցվել են մարդու գենոմին՝ օգտագործելով STAR (v2.6.0c), իսկ BAM ֆայլերը ինդեքսավորվել են SAMtools-ով (v1.11): Կրկնօրինակ ընթերցումները հեռացվել են umi_tools (v1.0.1)-ի միջոցով: Վերջապես, հավասարեցման հաշվարկը կատարվել է Subread-ում (v2.0.3) featureCounts-ի միջոցով: Որակի վերահսկողությունը իրականացվել է FastQC (v0.11.9) մեթոդի միջոցով՝ խողովակաշարի մի քանի միջանկյալ փուլերում։
Հետագա բոլոր կենսաինֆորմատիկական մշակումները և վիզուալիզացիաները կատարվել են R (v4.2.3) լեզվով՝ հիմնականում օգտագործելով Seurat (v4.4.0) աշխատանքային հոսքը։83 Հետևաբար, առանձին UMI արժեքները և մետատվյալների մատրիցները վերածվել են Seurat օբյեկտների։ Բոլոր մանրաթելերի 30%-ից պակաս արտահայտված գեները հեռացվել են։ Ցածր որակի նմուշները հեռացվել են՝ հիմնվելով 1000 UMI արժեքների և 1000 հայտնաբերված գեների նվազագույն շեմի վրա։ Վերջնական արդյունքում, 925 մանրաթել անցել է որակի վերահսկողության բոլոր ֆիլտրման փուլերը։ UMI արժեքները նորմալացվել են Seurat SCTransform v2 մեթոդով84, ներառյալ բոլոր 7418 հայտնաբերված հատկանիշները, և մասնակիցների միջև տարբերությունները ռեգրեսիայի են ենթարկվել։ Բոլոր համապատասխան մետատվյալները կարելի է գտնել լրացուցիչ տվյալների հավաքածու 28-ում։